可视化微孔板芯片检测结核分枝杆菌利福平及异烟肼耐药性研究

李永进，欧青叶，刘春晓，史 蕾，赵纯中，古莉冰，徐云庆，顾大勇

(1.长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025;2.深圳出入境检验检疫局，广东 深圳 518045)

结核分枝杆菌耐药性测定对有效指导临床用药、提高疗效、控制耐药结核病的传播具有重要意义[1]。目前，虽然有很多方法用于耐药性测定，但大都耗时较长，如耐药表型鉴定方法需要4～6周，因此开发快速、简便、准确的检测方法尤为必要。基因芯片是一种高通量的分析平台，将其应用于结核分枝杆菌耐药性检测已有很多相关的文献报道[2-4]。然而目前的基因芯片技术主要以荧光检测为主，单张芯片的样本通量低[5-7]。本研究采用微孔板芯片，根据利福平和异烟肼耐药与基因突变有关的分子机制，制备检测突变位点的基因芯片。该芯片检测的阳性结果在芯片表面直接以色点呈现，结果既可直接以裸眼观察，也可配套灰度扫描仪扫描分析。

材料和方法

一、材料

1.测试菌株及样本 所有测试耐药性菌株均由深圳口岸医院提供，耐药性菌株均经过绝对浓度法药物敏感性试验证实。

2.芯片制作、检测设备及配套试剂 微孔板芯片(N3 CHIP)、探针制备仪、灰度扫描仪均为台湾晶宇生物科技实业股份有限公司产品。探针、引物均由Invitrogen(广州)公司合成。其他试剂均为分析纯。

二、方法

1.引物、探针设计合成 针对利福平及异烟肼耐药相关的主要基因(rpoB、katG、inhA、ahpC)及结核分枝杆菌复合菌群设计5对引物，引物5'端以生物素标记，同时针对不同基因的高频率突变位点设计探针。……