酪蛋白磷酸肽—无定形磷酸钙对牙本质粘接界面耐pH循环老化的影响

唐成芳 窦祈 刘瑞瑞等

[摘要] 目的 研究局部应用酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙（CPP-ACP）对牙本质粘接界面耐pH循环老化的影响。

方法 常规制备牙本质粘接试件，将其随机分为3组，其中2组行pH循环，期间每日分别加用CPP-ACP、去离子蒸馏水（DDW）处理，15 d后测定微拉伸粘接强度，观察断裂模式、界面形貌及纳米渗漏，并确定混合层内元素含量。另一组试件制备完成后即刻测试。结果 无pH循环组及pH循环/CPP-ACP组微拉伸粘接强度差异无统计学意义，但二者均显著高于pH循环/DDW组（P<0.05）。试件均以混合破坏为主。pH循环/CPP-ACP组混合层质量优于pH循环/DDW组，纳米渗漏少。无pH循环组及pH循环/CPP-ACP组混合层内Ca含量显著高于pH循环/DDW组，Ag含量显著低于pH循环/DDW组（P<0.05）。结论 牙本质粘接界面局部应用CPP-ACP可增强界面耐pH循环老化的能力，延缓

界面退变。

[关键词] 酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙； 树脂-牙本质粘接； 再矿化； 粘接强度； 纳米渗漏

[中图分类号] R 783.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.002

口腔粘接技术奠定了口腔微创修复、美容修复的基础，已被广泛应用于口腔医学的各个分支领域，在现代牙科治疗中发挥不可替代的作用。尽管随着粘接技术的不断进步和粘接材料的更新换代，即刻粘接效果得到显著改善，然而由于牙本质结构的特殊性和口腔环境的复杂，牙本质粘接耐久性仍不尽人意。酸蚀剂脱矿程度和粘接树脂渗透能力不匹配以及亲水树脂单体比例过高等因素引起树脂向脱矿牙本质胶原网渗透不足，使混合层底部存在未完全被树脂包裹的裸露胶原，成为界面的薄弱区域[1]，易受到水、酶、细菌等因素影响而发生降解，破坏界面的完整和稳定，导致最终粘接失败[2-4]。在提高粘接耐久性的不断探索中，国内外学者提出了乙醇湿粘接技术[5]、抗菌粘接材料[6]、酶抑制剂[7]等众多措施，尽管能在一定程度上延缓粘接界面的老化，但由于裸露胶原未被封闭，因而胶原降解、粘接失败的风险依然存在。有学者[8-9]指出：如果能提供合适的再矿化条件，混合层底部的裸露胶原可以发生再矿化，以改善混合层质量，有助于提高粘接耐久性。

酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙（casein phospho-

peptide-amorphous calcium phosphate，CPP-ACP）是一种经典的再矿化活性物质[10-11]。大量研究[12-15]证实：局部应用CPP-ACP可抑制牙本质脱矿，并促进人工龋损处的再矿化。然而粘接后在界面区局部应用CPP-ACP是否对混合层局部裸露胶原亦有保护作用，促进其再矿化，增强界面薄弱区域而提高粘接耐久性，目前尚不明确。

本研究应用pH循环模拟日常进食过程中口内酸碱度的变化，旨在探讨粘接后局部应用CPP-ACP能否提高树脂-牙本质粘接界面耐pH循环老化的能力。 1 材料和方法

1.1 实验材料和器械

不含氟的护牙素（含10%CPP-ACP，GC公司，

日本），37%的磷酸凝胶（Vericom公司，韩国），牙

本质粘接剂（AdperTM Single Bond2，3M公司，美国），复合树脂（Filtekz250，3M公司，美国），硝酸银（上海科丰化学试剂有限公司）。

2.5%CPP-ACP溶液：护牙素与去离子蒸馏水（distilled and deionized water，DDW）以1∶3的比例振荡混匀备用；中性缓冲液[16]：用DDW溶解配制，含20 mmol·L-1羟乙基哌嗪乙磺酸、2.25 mmol·L-1 CaCl2·2H2O、130 mmol·L-1 KCl、1.5 mmol·L-1 KH2PO4，pH为7.0；酸性缓冲液[16]：50 mmol·L-1 CH3COOH、

2.25 mmol·L-1 CaCl2、130 mmol·L-1 KCl、1.5 mmol·L-1 KH2PO4，pH为5.0。

万能测试机（EZ test，Shimadzu公司，日本），体视显微镜（MLC-150，Motic公司，美国），场发射扫描电镜（field emission scanning electron microscopy，FE-SEM）、X线能谱仪（Hitachi公司，日本）。

1.2 样本制备

收集12颗新近拔除的无龋坏、完整的第三磨牙，浸泡于含有0.002%叠氮钠的4 ℃生理盐水中备用。采用慢速切割机在流水降温条件下垂直于牙长轴去除冠方釉质，暴露牙本质。牙本质表面采用600目碳化硅砂纸在流水下打磨30 s，超声清洗30 s后，气枪吹干，用37%的磷酸凝胶酸蚀15 s，流水冲洗30 s，湿棉球轻轻蘸干表面多余的水分，按说明书的使用方法涂布Single Bond2粘接剂并用棉棒搅动15 s，气枪轻吹10 s，按同样方法再涂布一层轻吹，光照固化10 s，分层堆塑Filtekz250复合树脂至4 mm厚度。在室温下水存24 h后，其中6颗牙制备8 mm×4 mm×2 mm的牙本质片状粘接试件18片，6颗牙制备8 mm×0.7 mm×0.7 mm的微拉伸条状试样135条，使粘接界面位于试件的中央。牙本质粘接片状试件表面距粘接界面1 mm以外区域均匀涂布两层抗酸指甲油备用。

1.3 分组表面处理及pH循环

每颗牙的微拉伸试件及片状试件分别随机分为无pH循环组、pH循环/DDW组和pH循环/CPP-ACP组。将后2组试件置于37 ℃恒温水浴中按照如下步骤进行pH循环处理：酸性缓冲液中浸泡30 min，DDW或2.5%CPP-ACP溶液中分别浸泡5 min，最后放入中性缓冲液中浸泡处理10 min。每步处理之间均采用去离子水冲洗1 min，1 d循环3次，其余时间试件置于中性缓冲液中，共循环处理15 d，每天换液1次。

1.4 微拉伸强度测试及断裂模式分析

pH循环15 d后，分别从pH循环/DDW组、pH循环/CPP-ACP组选43条微拉伸试件，将试件用502胶固定在专用夹具上，并于万能测试机上以0.5 mm·min-1的加载速度测试拉伸断裂时的最大载荷值（N），并计算单位面积断裂强度（MPa），即微拉伸强度[4]。无pH循环组试件制备完成后即刻测定微拉伸强度。

收集粘接强度测试后断裂试件的牙本质断端，体视显微镜下观察断裂模式。按照断裂部位，分为4种类型[17]，具体如下。1）界面破坏：断裂发生于粘接剂和牙本质界面或粘接剂与复合树脂界面，也包括粘接剂内聚破坏；2）混合破坏：牙本质或树脂内聚破坏与界面破坏在断裂面中并存；3）树脂内聚破坏：断裂发生在复合树脂内；4）牙本质内聚破坏：断裂发生于牙本质内。然后从中选取2～3个粘接强度接近于平均值的试样，自然干燥，喷金，FE-SEM下观察牙本质断端显微形貌。

1.5 粘接界面表面显微形貌观察

pH循环15 d后，分别从pH循环/DDW组、pH循环/CPP-ACP组随机选取微拉伸试件各2条，流水冲洗，自然干燥，喷金，FE-SEM观察粘接界面显微形貌。无pH循环组试件制备完成后即刻观察。

1.6 粘接界面X线能量色谱分析（energy-dispersive

X-ray spectrometry，EDS）及纳米渗漏观察

片状粘接试件避光浸泡于50%氨化硝酸银溶液24 h后，蒸馏水冲洗5 min，置于显影液中荧光照射显影8 h，使Ag+充分还原，流水冲洗5 min[18]。依次用1 200、1 500、2 000目的碳化硅砂纸流水下打磨试件至1 mm厚度，超声清洗30 s，自然干燥，喷金，FE-SEM背散射电子模式下观察粘接界面纳米渗漏，采用X线能谱仪线扫描模式分析粘接界面Si、P、Ag、Ca元素的分布情况，定性观察界面内部的再矿化效果。结合EDS线扫描结果，确定每个试件混合层的确切范围，并在矩形选区内分析Ca、P、Ag、Si以及Pt的原子百分比含量[19]，以定量评价混合层内的相

对矿化情况和微渗漏程度，每个试件选5个视野，求平均值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 14.0统计软件对实验数据进行统计分析，对微拉伸粘接强度及混合层Ag、Ca原子百分比含量进行单因素方差分析，组间采用LSD两两比较；对各组断裂模式采用卡方检验进行组间比较，α=0.05。

2 结果

2.1 微拉伸粘接强度及断裂模式

各组微拉伸粘接强度测量结果见表1。pH循环

15 d后，可见pH循环/CPP-ACP组与无pH循环组微拉伸强度差异无统计学意义，两者均显著高于pH循环/DDW组（P<0.05）。断裂模式的分析结果见表1和图1。

各组断裂模式均以混合破坏为主，但pH循环/DDW组界面破坏较无pH循环组呈增高趋势，且混合层底部破坏较多，但差异无统计学意义（P>0.05）。而pH循环/CPP-ACP组界面破坏显著低于pH循环/DDW组（P<0.05），且混合层顶部破坏较多，树脂内聚破坏明显增加，但差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 粘接界面微观形貌

无pH循环组试件表面可见玷污层，粘接界面显微结构不甚清晰，但未见明显微裂隙；pH循环/DDW组粘接界面存在明显的微裂隙，混合层较疏松，牙本质端小管清晰，牙本质表面可见大小不等的疏松颗粒；pH循环/CPP-ACP组粘接界面无明显裂隙，混合层相对致密，牙本质表面有大量致密的颗粒沉积（图2）。

2.3 粘接界面内EDS分析及纳米渗漏观察

粘接界面内背散射观察结合EDS线扫描结果见图3。由图3可见，图中白线表示进行线扫的部位，红色代表硅元素，绿色代表磷元素，深蓝色代表银元素，天蓝代表钙元素，各种颜色的线条出现峰值的部位代表了该部位含有很高浓度的相应元素。各组银染均主要集中在混合层内，但程度有所不同。无pH循环组银染最少，基本位于混合层基底部，渗漏不明显。pH循环/DDW组混合层内银染程度明显增加，部分区域银染布满全层；pH循环/CPP-ACP组银染程度略高于无pH循环组，但明显轻于pH循环/DDW组，银颗粒主要位于混合层基底部，大部分区域银染不明显。

无pH循环组、pH循环/DDW组钙、磷含量自牙本质顶向混合层顶部呈逐渐降低的趋势，到粘接剂层和树脂层基本恒定，且pH循环/DDW组钙下降更加明显。pH循环/CPP-ACP组自混合层基底向顶部钙、磷含量明显高于粘接剂层，但低于牙本质，分布基本均匀。混合层选区扫描结果见表2。由表2可见，pH循环/CPP-ACP组Ca、Ag原子百分比含量与无pH循环组相比较差异无统计学意义（P>0.05）；无pH循环组和pH循环/CPP-ACP组Ca原子百分比含量均显著高于pH循环/DDW组（P<0.05），而Ag原子百分比含量显著低于pH循环/DDW组（P<0.05）。

3 讨论

粘接修复体在口腔中受到细菌产酸、酶以及水环境等各种因素影响可破坏粘接界面的稳定性[2-4]。

pH循环可模拟日常口腔环境中酸碱度和矿物质饱和度的动态变化，比水存老化更接近口腔实际环境，被广泛用于龋病防治、粘接耐久性及再矿化研究[16，20-21]。

因此本研究采用pH循环老化方式测试粘接完成后局部应用CPP-ACP能否延缓粘接界面老化的发生。

用于粘接界面扫描电镜观察的试件常规会进行短暂的酸处理或表面镜面抛光，以去除切割试件时形成的玷污层对显微形貌的遮盖。而本实验中pH循环组试件经pH循环中的酸处理已经去除了玷污层，就没有另行酸处理，而无pH循环的试件作为阴性对照，采用了与经pH循环试件相同的扫描电镜观察前的样本处理步骤，因而玷污层未被去除，导致该组FE-SEM观察时粘接界面显微形貌结构不清晰。

pH循环15 d后，pH循环/DDW组粘接界面表面出现明显微裂隙，混合层疏松，而pH循环/CPP-ACP组试件混合层较致密。无pH循环组及pH循环/CPP-ACP组微拉伸强度显著高于pH循环/DDW组（P<0.05）。

结果表明，pH循环后粘接界面发生了明显老化，这与Peris等[21]的研究结果一致，即pH循环后粘接强度会发生显著下降。这可能是酸性缓冲液激活了内源性的金属基质蛋白酶，加剧了混合层底部裸露胶原纤维的降解及树脂酯键的水解，加速了界面稳定性破坏的缘故[2-3，21]。此外，酸性缓冲液pH为5.0的弱

酸，可能使粘接界面内钙离子进一步流失，进而可能形成继发龋[21]，减弱牙本质端强度。本研究中断

裂模式分析进一步印证了上述结果。pH循环/DDW组界面破坏及牙本质内聚破坏比例较无pH循环组略增高，且混合层底部破坏较多，这可能是由于pH循环过程中的酸处理导致牙本质端脱矿从而削弱了牙本质及混合层。而pH循环/CPP-ACP组界面破坏显著减少，且混合层顶部破坏较多，树脂内聚破坏呈增加趋势，可能与CPP-ACP的应用减弱了酸对牙本质的作用，并使牙本质发生了再矿化，相对加强了界面及牙本质端的原因有关。粘接界面EDS及纳米渗漏观察也提示pH循环加剧了界面老化，加重了纳米渗漏的程度，CPP-ACP能改善树脂-牙本质粘接界面的耐pH循环老化性能，相对减轻纳米渗漏，延缓界面老化。

CPP-ACP延缓粘接界面混合层老化的作用可能与以下机制有关：1）CPP-ACP稳定钙磷，有助于混合层的矿物沉积。CPP-ACP是富含磷酸丝氨酸的生物活性肽与无定形磷酸钙结合形成纳米尺度的复合体，其能将非晶态的磷酸钙固定于牙齿表面，并维持混合层再矿化需要的过饱和的钙磷离子浓度，形成再矿化所需的离子渗透梯度，从而促进混合层及脱矿牙本质的再矿化[10-12，22-23]。2）CPP-ACP已被证实具有抑制牙本质脱矿的作用，其机制可能与CPP-ACP释放碱性氨基酸并接受氢离子，阻碍其扩散或者释放钙离子相关[15，23]。本实验中CPP-ACP究竟是促进再矿化还是抑制脱矿起决定作用尚待进一步研究。

本研究证实了CPP-ACP局部应用可提高粘接界面耐pH循环老化能力，促进混合层矿物沉积，提高粘接界面耐久性，但受试粘接剂类型局限，且观察时间较短，其长期效果还有待进一步研究证实。

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（本文采编 陈谦明）