复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒的初步实验研究

谭本仁 徐晓梅 罗 君 郭基燕 许卫关

1.汕头大学医学院附属粤北人民医院，广东韶关 512026；2.广东省韶关市食品药品检验所，广东韶关 512028

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的感染会导致急慢性乙型肝炎的发生，是引起肝硬化、肝细胞癌的重要因素之一，每年约有50 万人死于由HBV 感染引起的急性肝炎、肝硬化及肝癌等疾病[1-2]，目前临床尚无治疗乙肝的特效药物。复方叶下珠滴丸是由叶下珠、半边莲、半枝莲、鸡骨草、茵陈、丹参、柴胡等十六味草药经科学提取工艺精制而成的滴丸，具有疏肝解郁，益气健脾，抗乙肝病毒，改善肝功能、调节免疫机能等功效，能防治急慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。本实验采用酶联免疫吸附检测（ELISA）技术和荧光定量（PCR）方法，分析复方叶下珠滴丸对HepG2.2.15 细胞培养液及HBsAg 阳性人血清培养液中HBsAg、HBeAg 及HBV DNA 含量的影响， 观察复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒的作用。

1 仪器与材料

1.1 试药与试剂

试药：采用复方叶下珠滴丸处方中十六味草药以水提醇沉法（加水十倍，煎煮1 h，醇沉浓度为60%）制成的流浸膏（每1 mL 含原生药材1 g）为试药。

试剂：HBsAg、HBeAg 诊断试剂盒 （新波生物技术公司）， 靶细胞选择HepG2.2.15 细胞 （HBV 全基因传染的HepG2 细胞），HBV DNA 荧光定量PCR 试剂盒（上海复兴生物技术公司）。

1.2 仪器

EFFICUTA2710 免疫分析仪和全自动样本前处理系统，Roche Light Cycler480Ⅱ实时荧光定量PCR 系统，37℃5%CO2培养箱（Phermo）。

1.3 统计学方法

采用SPSS v19.0统计软件进行处理，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，比较采用t 检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 方法与结果

2.1 细胞培养

将HepG2.2.15 细胞按1 ×105/mL 浓度加入2个24 孔培养板中，放入37℃5%CO2培养箱培养4 d 后换液，将试药稀释，分八组不同浓度药液各滴入4个孔，空白对照组以生理盐水滴入，亦4个孔，加药培养于72 h 后各收取1孔细胞上清液，用 ELISA 测定 HBsAg、HBeAg 和PCR 检测其HBV DNA 含量，并将每组数据与空白对照组进行配对T 检验，结果见表1。

根据以上实验，确定复方叶下珠滴丸试药最佳抑制效果浓度为120mg/mL。为考察其最佳抑制时间，再以120mg/mL浓度的复方叶下珠滴丸试药，按以上方法培养，加药培养后于 24、48、72、96 h 后收取 1 孔细胞上清液再检测其HBsAg、HBeAg 和 HBV-DNA，48、72、96 h 组间数据分别与24 h 组进行统计学分析，结果见表2。

表1 不同浓度的复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒活性结果比较（±s）

表1 不同浓度的复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒活性结果比较（±s）

注：与空白对照比较，*P<0.01

复方叶下珠滴丸浓度（mg/mL）HBsAg 含量（ng/mL）HBeAg 含量（PEIU/mL）HBV-DNA 含量（IU/mL）20 40 60 80 100 120 140 160空白对照1.851±0.047*1.740±0.110*0.956±0.017*0.742±0.014*0.562±0.012*0.543±0.005*0.521±0.015*0.552±0.014*2.657±0.257 5.245±0.155*5.234±0.139*5.190±0.138*5.123±0.129*5.101±0.135*4.722±0.144*4.025±0.167*5.081±0.138*6.359±0.106 549 500±17 517 502 300±17 658*464 500±15525*412 700±15697*293 200±21 740*98 700±2 804*121 000±12 152*109 000±13 321*554 300±19 794

表2 不同时间的复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒活性结果比较（±s）

表2 不同时间的复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒活性结果比较（±s）

注：与24 h 组比较，*P<0.01

项目 24 h 48 h 72 h 96 h HBsAg 含量（ng/mL）HBeAg 含量（PEIU/mL）HBV-DNA 含量（IU/mL）1.812±0.0800.641±0.012*0.533±0.022*0.535±0.024*5.321±0.2185.065±0.1444.101±0.135*4.067±0.140*546300±18621312 500±16 800*75700±987*43 500±1 848*

2.2 血清培养

将复方叶下珠滴丸试药稀释为120 mg/mL 溶液分5 组加入HBsAg 阳性人血清（HBsAg 为2.634 ng/mL，HBeAg 为4.799 PEIU/mL，HBV-DNA 为 650 300 IU/mL）， 对照组则加入生理盐水，于37℃孵育72 h，取上清液分别用ELISA测定各组HBsAg、HBeAg 和 PCR 测定各组HBV-DNA，并作统计学分析，结果见表3。

表3 复方叶下珠滴丸对抗人体血清结果比较（±s）

表3 复方叶下珠滴丸对抗人体血清结果比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.01

组别 HBsAg 含量（ng/mL）HBeAg 含量（PEIU/mL）HBV-DNA 含量（IU/mL）试药组（120 mg/mL，n=5）对照组（n=5）0.992±0.066*2.253±0.151 3.561±0.163*4.885±0.106 102 500±7 069*651 200±21 998

3 讨论

复方叶下珠滴丸是以叶下珠为主药经科学提取工艺精制而成的滴丸，叶下珠为大戟科植物，有清热利尿、平肝明目、消积解毒、止泻之功效，含鞣质类、黄酮类、香豆素类等多种活性成分[3]，对肝损害具有保护作用，能预防原发性肝癌发生[4]，具有抗肝纤维化、抗乙型肝炎病毒的作用[5]，并对肝癌、胃癌多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用[6-7]。辅药中半边莲对肝癌也有明显的抑制作用[8]，半枝莲则可提高机体的抗氧化能力，对肝损伤有保护作用[9]，鸡骨草也有显著的抗乙肝病毒作用[10]。

在HepG2.2.15 细胞培养实验中，随着复方叶下珠滴丸试药浓度的增加，对乙肝病毒的抑制作用逐渐增强，呈现一定的剂量依赖性，但其试液浓度为140 mg/mL 时对HB-sAg、HBeAg 抑制作用最强，而其对HBV DNA的抑制作用最强浓度则为120 mg/mL；而其最佳抑制时间的培养试验中，72 h 组与96 h 组中的HBsAg、HBeAg 浓度降低并无差异，HBV DNA 抑制作用却与时间呈一定的依赖性；在血清学培养实验结果显示，复方叶下珠滴丸能显著降低HBsAg浓度，具有明显抗HBV的作用。实验结果表明，复方叶下珠滴丸具有明显的抗乙肝病毒作用，今后笔者将做进一步的药效学研究，为临床使用提供实验依据。

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