奶牛体细胞核移植胚胎产业化生产条件优化

孙伟 巴特尔 郭继彤 李荣凤 王建国 李明胡树香 王春生 李喜和，3

到目前为止，绵羊［1］、山羊［2］、牛［3］、猪［4］、小鼠［5］、］马〔6〕、骆驼［7］及马鹿［8］等多种动物通过体细胞核移植技术获得了健康成活的后代。体细胞克隆技术是利用供体动物细胞的DNA作为基因表达的模板，可以使克隆后代与供体动物的遗传性状完全相同，从而使动物品种的优良性状得以复制，所利用该技术进行良种动物遗传资源的扩繁产业前景广阔。

伴随着国内乳品企业规模的迅速扩张，对抗病力强、生产性能优秀的高产奶牛的遗传资源需求量增加，同时由于美加系高产活体奶牛进口的限制，只有通过引进高产奶牛细胞系，利用体细胞克隆技术与胚胎移植技术结合是实现高产奶牛快速扩繁的捷径，达到高效组建高产奶牛核心群的目的。目前，奶牛克隆胚胎重构存在技术操作繁琐，生产效率低等问题，要想实现产业化，必须简化操作程序，提高整体效率。本试验拟对高产奶牛克隆胚胎生产关键环节进行系统优化，以达到简化操作程序和提高效率为目的，为获得批量、高质量的高产克隆奶牛后代奠定了技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂、仪器及配方 TCM199（Gibco，11150-059），FSH（Sigma，F8174），17-β-E2（Sigma，E8-875），FBS（Gibco，16000-036），Cytochalasin-B（Sigma，C6762），Hyaluronidase（Sigma，H4272），Sodium pyruvate（Sigma，P3662），D-Mannitol（Sigma，M9546），6-DMAP（Sigma，D2629），Ionomycin（Sigma，10634），Peni/Strep（100×）（Gibco，150-70），BSA（Austrilian，ICP/biologicals AVIVP-100G），99.999％混合三气（5％CO2-5％O2-90％N2）（北京普莱克斯适用气体有限公司）。

体视显微镜（NIKON，SMZ1500），显微操作仪（日本NIKON，TE2000），细胞融合仪（澳大利亚公司生产，IP-1）。

成熟液组成 ：TCM199+10％ FBS+1μg/mL 17-β-E2+10mmol/L Hepes+0.12mg/mL Pyruvate+0.1mg/mL Strepolin+0.125mg/mL penicilla-mine+10μg/mL FSH）。

融合液组成：0.25mmol/L D-C6H14O6，0.5mmol/L Hepes，0.05mmol/L（C2H3O2）Mg·4H2O，0.01％BSA，0.1mmol/L Ca（C2H3O2）2。

发育液组成：107.7mmol/L NaCl，7.15mmol/L KCl，0.3mmol/L KH2PO4，25mmol/L NaHCO3，3.32mmol/L sodium lactate，0.04mmol/L kanamycinmonosulfate，0.33mmol/L pyruvate，1.71mmol/L CaCl2·2H2O，6mmol/L fatty-acid free bovine albumin，0.001mmol/Lheparin，0.2mmol/L penicillamine，0.1mmol/L Strepolin。

1.1.2 卵巢采集 卵巢采集于呼和浩特市郊区清真屠宰场。采集的卵巢保存于25-30℃灭菌生理盐水保温瓶中，在4h内运至实验室。……