毕赤酵母高效表达整合有CBD的米黑根毛霉脂肪酶

薛冲冲 张俊辉 林影 韩双艳

脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3），指一系列能在油-水界面水解三酯酰甘油的酶类。其中米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucormiehei lipase，RML）是一种重要的、有代表性的脂肪酶，它可以催化酯水解、酯合成、酸解、醇解、氨解、内酯化、转酯化等多种类型的反应［1］。由于RML具有独特的催化结构，并且能显示高度的底物1，3位置专一性［2］，使其相对于其他一些工业脂肪酶，如南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）具有更好的底物选择性和特异性。因此其在油脂、制药、香精香料、化工等领域有着重要的应用价值［3］。

毕赤酵母表达系统具有可进行高密度发酵、表达量较高、对蛋白质进行修饰、糖基化程度低等优点，应用该系统成功地表达了大量的外源蛋白［4，5］。本实验室也将RML在毕赤酵母中进行了表达，但是其表达量比较低，造成生产成本较高，和商业化酶相比仍有较大的差距。因此有必要提高RML在毕赤酵母中的表达水平，降低其成本和价格，促进其工业化大规模使用。

2004年 Ahn等［8］将来源于哈茨木霉内切葡聚糖酶II（THEGII）的CBD与嗜热脂肪芽孢杆菌的L1脂肪酶在酿酒酵母中融合表达，融合蛋白CBDLinker-L1Lipase相比较L1-Lipase的分泌量会显著提高7倍。故本研究尝试通过该CBD与RML在毕赤酵母中进行高效的融合表达，以期获得高酶活力的RML，为进一步的降低应用于工业生产的RML的生产成本，有目的改善RML的相关酶学性质奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 Pichia pastoris GS115、菌株E.coli Top10F'由本实验室保存，重组质粒pPICZαA-RML由本实验室构建、pUC57-CBD-L由金斯瑞生物科技有限公司合成，质粒 pPICZαA 购自Invitrogen公司。……