黑曲霉葡萄糖氧化酶高产基因工程菌研究进展

刘瑜 李丕武

1 葡萄糖氧化酶简介

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）最早在黑曲霉的提取物中发现［1］，系统名称为β-D-葡萄糖：氧1-氧化还原酶（EC 1.1.3.4）。它能够催化β-D-葡萄糖被氧气氧化成葡萄糖酸-δ-内酯，并生成过氧化氢［2］。生成的葡萄糖 -δ-内酯随后自发水解［2］或者在内酯酶的作用下水解成葡萄糖酸［3］。相关反应，如图1所示。

图1 葡萄糖氧化酶酶促反应［4］

GOD应用广泛，可用于葡萄糖传感器制造［5］、面粉添加剂［6］、葡萄糖酸及其盐生产［7］和生物燃料电池［8］等领域。因此，寻求更有效的GOD的生产方法具有重要的现实意义。目前生产GOD的微生物有黑曲霉（Aspergillus niger）［9］、尼琦青霉（Penicillium amagasakiense）［10］、变幻青霉（Penicillium variabile）［11］和软毛青霉（Penicillium puberulum）［12］等，其中以黑曲霉最为重要。

2 黑曲霉GOD结构性质简介

黑曲霉GOD含有两个相同的亚基，两个亚基通过两个二硫键相结合［13］，每个亚基含有一个紧密非共价结合的 FAD 分子［14］。Swoboda 和 Massey［15］测得相对分子质量为18.6kD，热变性或化学变性（8mol/L尿素）后测出每分子含有1个巯基和两个二硫键，酶分子糖含量为16.5％（±0.8％），如此高的糖含量使得黑曲霉GOD具有很多不寻常的性质：100℃时不发生沉淀；对0.75％的十二烷基硫酸钠（SDS）稳定；5％的三氯乙酸只能使其缓慢沉淀；在水中的溶解度较高，需要较高浓度的盐才能沉淀（80％-90％ 硫酸铵）。Nakamura和 Fujiki［16］测定其含有的糖主要是甘露糖、葡萄糖和己糖胺。Kalisz等［17］测得最适pH5.5-6.0，且糖链对酶的结构、稳定性和活力不起主要作用。1989年，Kriechbaum等［18］首先克隆了黑曲霉NRRL-3的GOD基因，该基因由1 815个碱基对组成，编码一个亚基的605个氨基酸残基。由于成熟的酶的一个亚基含有584个氨基酸残基，因此确定有21个氨基酸残基组成了信号序列。……