燕麦嗜酸菌鞭毛素的提纯及其活性检测

伍甜 刘莹 余超 边强 田芳 黄琼 陈华民 何晨阳

鞭毛素（flagellin）是细菌鞭毛的主要组分，不仅与鞭毛运动性有关，而且可以作为病原相关分子模式（PAMP）激发植物的免疫反应（PTI）［1］。其N 端有一个由 22 个氨基酸组成的保守肽段 flg22，通过与植物受体FLS2 的识别及其信号传导，最终诱导了拟南芥、番茄和烟草等植物的防卫反应［2-5］。同样，通过flg22与水稻受体 OsFLS2 的识别作用，也可引起水稻的防卫反应，但这种反应很微弱；而flg22或鞭毛素却能激发过表达OsFLS2的水稻悬浮细胞强烈的防卫反应［6］。燕麦嗜酸菌（Acidovorax avenae sub.avenae，简称Aaa）不亲和菌株N1141的鞭毛素能够引起水稻过敏反应，并伴随着大量H2O2的产生［7，8］。表明细菌鞭毛素作为PAMP对单子叶植物水稻PTI 的诱导作用机理比较复杂，有必要进行深入的探究。

本研究采用机械震荡、丙酮沉淀以及离子交换层析进行了蛋白提纯，并对其诱导水稻产生 H2O2的能力进行测定，旨在探索一种能够大量提纯的可行方法，并且获得提纯、有活性的鞭毛素蛋白，用于后续的水稻 PTI 机理的解析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 供试菌株：Aaa菌株NB001由中国检验检疫科学院赵文军研究员提供。水稻品种：日本晴（Oryza sativa ssp.japonica）由本实验室保存。Aaa 菌株NB001与水稻品种日本晴的存在不亲和互作关系。

1.1.2 主要试剂 KB 培养基（20g蛋白胨、10mL甘油、1.5 g K2HPO4、1.5gMgSO4·7H2O、1000mL H2O）；2×SDS 电 泳上样缓冲液（0.0615mmol/L Tris-HCl，pH6.8；1％ SDS，10％ 甘油，5％ β-巯基乙醇，0.002％溴酚蓝）；染色液（0.125g考马斯亮蓝R250、30mL甲醇、10mL冰乙酸、加H2O定容至100mL）；脱色液（30mL甲醇、10mL冰乙酸，加H2O 定 容 至100mL）；PBS（0.27 g KH2PO4、1.42 g Na2HPO4、NaCl 8g，KCl0.2 g、调节pH至7.4，加水定容至1L）；抗鞭毛素蛋白兔多克隆抗体（华大公司）；HRP标记的羊抗兔 IgG 抗体（华大公司）；……