乳鼠心肌微血管内皮细胞体外原代培养与鉴定的实验研究

张颖倩，胡舜英，陈韵岱

血管内皮细胞作为血管最内层细胞，直接接触血液，具有保持血管的完整性与稳定性，抗血小板聚集、维持血管张力等生理功能。心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)与大血管内皮细胞及各脏器微血管内皮细胞之间表现出不同的功能异质性［1］。CMECs可通过分泌活性物质直接影响心肌细胞［2］，并参与缺血/再灌注损伤［3］、无复流现象等病理生理过程。原代CMECs的分离培养对研究缺血/再灌注损伤、微血管功能障碍、冠心病的治疗等有重要意义。本实验在Peters实验［4］的基础上进行了改进，在保证细胞纯度的前提下进一步提高了CMECs的收获率，成功分离并培养了纯度、成活率均较高的原代CMECs。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 CO2培养箱(Heraeus)，超净台(北京亚泰科隆)，酶标仪(Biotec)，摇床(北京欧诺)，倒置荧光显微镜(Olympus)，流式细胞仪(B＆D)。

1.2 实验动物与试剂 SD大鼠乳鼠，5～7 d，体重12～15 g，雌雄不限，购自解放军总医院实验动物中心，动物许可证编号:SCXK(京)2012-0001。高糖DMEM干粉(Gibco)，Ⅰ型胶原酶(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，PBS(Hyclone)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Hyclone)，重组人血管内皮生长因子(VEGF，中科物源)，兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体(中杉金桥)，兔抗鼠CD31多克隆抗体(中杉金桥)，FITC标记的山羊抗兔IgG(中杉金桥)，AnnexinⅤ-FITC＆PI凋亡检测试剂盒(嘉美生物)，二甲基亚砜(DMSO，Gibco)。

1.3 实验方法

1.3.1 乳鼠CMECs的分离与培养:乳鼠脱臼处死，无菌条件下取左心室，放入冰浴PBS+肝素钠溶液中，眼科剪和眼科镊去除左心室外1/4层组织、心内膜、心外膜及瓣膜。沿室间隔剪开左心室，95%乙醇浸泡20 s，灭活残余的心内膜和心外膜细胞。PBS冲洗，将心肌组织剪为 0.5 mm ×0.5 mm ×0.5 mm的组织块。……