胆酸细菌内毒素检查方法的建立

杨昀，胡宇驰，周建平，曹春然

(北京市药品检验所，北京 100035)

胆酸在水中溶解度较低(15℃时仅为0.28 g/L)，无法采用一般的家兔法进行热原项目检查。鲎试剂与细菌内毒素的反应一般都是在水溶液中进行，也无法直接用细菌内毒素检查用水溶解本品进行细菌内毒素凝胶法检查。胆酸可溶于乙醇(15℃时在乙醇中的溶解度为30.56 g/L)，也溶于碱溶液，因此考虑以乙醇或碱性溶液为溶剂，将胆酸溶解后进行细菌内毒素检查。有研究将胆酸分别与1.0mol/L的NaOH溶液和细菌内毒素检查用水混合溶解，稀释后制成质量浓度为0.375 g/L的供试品溶液后再进行细菌内毒素检查。但碱性溶液对于胆酸中可能含有的细菌内毒素是否有干扰作用，尚无进一步研究的资料。因此，本试验分别使用无水乙醇和1.0mol/L的NaOH溶液分别溶解胆酸，进行细菌内毒素方法学研究;并采用外加细菌内毒素的方法，研究无水乙醇和1.0mol/L的NaOH溶液溶解胆酸是否对细菌内毒素产生干扰。

1 试验材料

胆酸原料，类白色粉末，3批样品(New Zealand Pharmaceuticals Ltd.，批号分别为 0310107，0310108，0310109);鲎试剂(福州新北生化工业有限公司，批号为11110812，灵敏度为0.125EU/mL;批号为 12040612，灵敏度为 0.03 EU/mL，规格均为 0.1mL);鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，批号为1109071，灵敏度为0.25 EU/mL;批号为 1104211，灵敏度为 0.125 EU/mL，规格均为0.1mL);细菌内毒素标准品(中国药品生物制品检定所，批号为150601－201072，规格为每支120 EU);细菌内毒素检查用水(中国药品生物制品检定所，批号为201001，规格为每支10mL);无水乙醇(北京现代东方精细化学品有限公司，批号为20111118)为分析纯。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核

按照2010年版《中国药典(二部)》附录ⅪE细菌内毒素检查法规定[1]，进行鲎试剂灵敏度复核，结果4批鲎试剂用细菌内毒素标准品检查，λc均为 λ的0.5～2.0倍，表明鲎试剂的灵敏度均符合规定。

2.2 内毒素限值(L)确定

胆酸为药用辅料，内控标准内毒素的限值为360 EU/g。

2.3 胆酸有效稀释浓度(MVC)

按公式 MVC=λ/L计算，其中L为胆酸的细菌内毒素限值360 EU/g，λ为鲎试剂标示灵敏度，目前市售鲎试剂灵敏度λ通常是 0.5，0.25，0.125，0.06，0.03 EU/mL。则对应的胆酸有效稀释质量浓度分别为 1.39，0.69，0.35，0.17，0.087 g/L。

2.4 胆酸溶液制备

由于胆酸微溶于水，无法直接制备水溶液进行细菌内毒素试验。但胆酸可溶于乙醇(15℃时在乙醇中的溶解度为30.56 g/L)，也溶于碱溶液，因此分别以无水乙醇和1.0mol/L的NaOH溶液为溶剂，将胆酸溶解后再进行细菌内毒素方法学试验。

2.5 干扰试验预试验

2.5.1 无水乙醇处理

精密称取胆酸140mg，加入无水乙醇5mL，超声振荡1min溶解制成胆酸贮备液。再将贮备液中加入细菌内毒素检查用水，分别稀释为 1.4，0.7，0.35，0.175，0.087 5 g/L，将此系列稀释溶液记为NPC(此系列稀释溶液中的乙醇浓度分别为5%，2.5%，1.25%，0.625% ，0.312 5%，以下均同)。

为验证经无水乙醇处理和短时间超声振荡对细菌内毒素的影响，另精密称取胆酸140mg，加入无水乙醇5mL，细菌内毒素标准品适量，超声振荡1min溶解，制成含有细菌内毒素的胆酸贮备液。将上述贮备液稀释成上述系列浓度，并使每一浓度的稀释液中分别含有2λ及0.25λ浓度的细菌内毒素，此系列溶液分别记为PPC1和PPC2。

取灵敏度分别为0.25，0.125 EU/mL的两个不同厂家的鲎试剂，分别与上述PPC1，PPC2和NPC系列溶液进行反应;并以细菌内毒素检查用水设立阳性和阴性对照，记为NC，依法进行干扰试验预试验。结果见表 1。可见，胆酸在 0.35 g/L(乙醇浓度1.25%)及其以下稀释浓度时对试验无干扰，且说明无水乙醇的处理和短时间内的超声振荡在一定程度内未对细菌内毒素干扰预试验结果产生影响。

表1 胆酸干扰预试验结果(无水乙醇处理/0.1mol/LNaOH溶液处理)

2.5.2 1.0mol/LNaOH 溶液处理

精密称取胆酸 350mg，加入 1.0mol/LNaOH 溶液 0.8mL，细菌内毒素检查用水9.2mL充分振荡溶解，制成胆酸贮备液，据需要，调节胆酸贮备液pH在6～8之间。再将贮备液中加入细菌内毒素检查用水分别稀释为 1.4，0.7，0.35，0.175，0.087 5 g/L，将此系列稀释溶液记为NPC。

为验证经1.0mol/LNaOH溶液处理对细菌内毒素的影响，另精密称取胆酸 350mg，加入 1.0mol/LNaOH 溶液 0.8mL，细菌内毒素检查用水9.2mL及细菌内毒素标准品适量，充分振荡，制成含细菌内毒素的胆酸贮备液。将上述贮备液稀释成上述系列浓度，并使每一浓度的稀释液中分别含有2λ及0.25λ浓度的细菌内毒素，此系列溶液分别记为PPC1和PPC2。

取灵敏度分别为0.25，0.125 EU/mL的两个不同厂家的鲎试剂，分别与上述PPC1，PPC2和NPC系列溶液进行反应;并以内毒素检查用水设立阳性和阴性对照，记为NC，依法进行干扰试验预试验。结果见表1。可见，经1.0mol/LNaOH溶液处理胆酸后，细菌内毒素干扰试验不成立。

2.6 正式干扰试验(无水乙醇处理)

根据表1两种处理方法的预试验结果，将3个批号的胆酸按2.5.1项下步骤处理后，取胆酸贮备液用细菌内毒素检查用水分别进行稀释，使其最终干扰试验稀释质量浓度为0.35 g/L(乙醇浓度1.25%)，按2010年版《中国药典(二部)》附录中的细菌内毒素检查供试品干扰试验项进行试验，结果见表2。结果表明，E s/E t均在0.5～2.0范围内，确认胆酸经无水乙醇处理后在0.35 g/L(乙醇浓度1.25%)的稀释质量浓度下无干扰。

2.7 样品细菌内毒素检查

分别选择灵敏度分别为0.03，0.125 EU/mL的两个厂家的鲎试剂，按2010年版《中国药典(二部)》附录ⅪE细菌内毒素检查法，对上述3批样品进行细菌内毒素检查，均符合规定。结果见表3。

3 讨论

胆酸微溶于水，因此无法采用一般的家兔法进行热原项目检查;凝胶法为细菌内毒素6种检查方法中最简单和常用的方法，且为细菌内毒素第一类检查的评估标准方法[2]，因此建立胆酸的细菌内毒素检查凝胶法非常必要。但鲎试剂凝胶反应一般是在水溶液中进行，因此需要解决胆酸在水中溶解度较低的问题。

胆酸可溶于乙醇，也溶于碱性溶液，本试验分别采用这两种溶剂进行试验研究。一般情况下乙醇对细菌内毒素有去除作用[3]。但另有文献报道，60%的乙醇溶液及超声对细菌内毒素的活性无明显影响，乙醇浓度稀释至4%～5%以下对内毒素和鲎试剂的凝集反应也无明显干扰作用[4－5]。参照本试验结果，本研究将细菌内毒素标准品外加入胆酸原料中，并用无水乙醇和超声振荡进行短暂处理，制成贮备液，并将贮备液进一步稀释制成供试品溶液进行细菌内毒素方法学验证。结果表明，无水乙醇短暂处理及短时间的超声振荡对细菌内毒素的活性无明显影响。而且经一系列稀释后，最终进行鲎试剂凝胶反应的供试品溶液中所含的乙醇浓度为5%及其以下浓度，对鲎试剂的凝集反应也未产生明显干扰作用。

在胆酸中预先外加细菌内毒素标准品后再使用1.0mol/L NaOH溶液和细菌内毒素检查用水溶解，干扰预试验不成立。此时溶液的pH在8～9之间，推测并非是pH对鲎试剂的凝集产生干扰。另取胆酸按拟订方法溶解后再外加细菌内毒素溶液，干扰消失，干扰预试验成立。由此推测1.0mol/LNaOH溶液溶解胆酸，发生酸碱中和反应，其反应过程对细菌内毒素产生影响，造成干扰试验不成立。根据2010年版《中国药典(二部)》附录ⅪE[1]要求，应使用预先添加标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。因此，使用1.0mol/LNaOH溶液溶解胆酸的方法不适用于胆酸的细菌内毒素凝胶法检查。

由于鲎试剂生产厂家不同，工艺不同，对供试品的抗干扰能力不同，故应根据实际情况选择适合的试验材料。

表2 胆酸(无水乙醇处理)正式干扰试验结果

表3 胆酸(无水乙醇处理)细菌内毒素检查结果

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录ⅪE.

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