U251和U87细胞的Ezrin蛋白生物信息学分析

刘乃杰 梁华新 秦治刚 孙利波 房晓萱 赵丛海 朱庆三

(吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033)

应用蛋白质组学和免疫组化检测发现，在不同来源的转移性肿瘤中，Ezrin蛋白高表达〔1～3〕。相对于良性上皮组织膜顶端的表达，胞浆高表达的Ezrin与人类乳腺癌去分化、侵袭和不良预后有关〔4〕。应用shRNA和Ezrin负调控区突变抑制 Ezrin功能，可阻止侵袭和早期转移〔5～7〕。研究发现Ezrin基因过表达与儿童横纹肌肉瘤和骨肉瘤临床分期相关，移植瘤模型证实减少横纹肌肉瘤或骨肉瘤细胞系Ezrin的表达可导致肺转移减少〔8〕。神经胶质瘤因其浸润性生长，使手术及放化疗效果均不理想。Tynninen等〔9〕研究发现Ezrin同样在神经胶质瘤高表达，且与神经胶质瘤的进展相关，与组织学细胞类型和WHO肿瘤等级相关。但不同肿瘤等级、不同浸润性神经胶质瘤Ezrin表达量不同的机制不清楚。本文对侵袭性不同的胶质瘤细胞系U87和U251的Ezrin蛋白序列进行生物信息学分析，拟寻找浸润性生长的机制，为神经胶质瘤的治疗寻求新的途径。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 组织RNA提取试剂盒、小量质粒提取试剂盒，北京博迈德科技发展有限公司;M-MLV反转录酶，Promega公司;Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mixture、Oligo d(T)15Primers、Random Primers、TaKaRa LA Taq®Hot Start Version、pMD®18-T vector、DL2000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ，宝生物工程(大连)有限公司;DEPC，Sigma公司。U251、U87细胞购自中国科学院细胞库。应用Primer Premier 5.0软件设计Ezrin基因的引物:EF216:5'-CTCGAGCTATGCCGAAACCAATCAATGTCCG-3'，ER1976:5'-GAATTCTTACAGGGCCTCGAACTCGTCGATG-3'，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 基因序列及蛋白结构分析工具 Basic Local Alignment Search Tool(nucleotide blast及 blastx)，EBI＞Tools＞Protein，SWISS-MODEL，SWISS-PDB Viewer。

1.3 方法

1.3.1 Transwell检测U251和U87细胞的迁移侵袭能力 取100 μl Matrix gel加至 Transwell小室中，置 37℃，待其凝固。0.25%胰酶消化收集细胞，计数，吸取100 μl(含1×105个细胞)加至Matrix gel表面，于37℃继续培养4～6 h，结晶紫染色，计数穿过膜底面的细胞。……