何首乌二苯乙烯苷对大鼠海马神经元L型钙离子通道的影响

朱秋双 任春清 包利泽 赵锦程 刘 蕾 白 雪 杨 玉 刘明远

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

脑组织细胞钙离子内流增加，能启动细胞凋亡通路，是阿尔茨海默病(AD)发病机制之一〔1〕。随着中国不可逆转的进入老龄化社会，AD已经成为影响我国人口健康和生活质量的公共健康问题，开发研究确实有效的预防治疗药物非常迫切。何首乌(Polygonum Multiflorum Thunb)据《本草纲目》记载有“益精髓、延年不老”之效。本课题组前期实验结果表明，何首乌对大鼠的学习记忆有保护作用，且能抑制海马细胞凋亡〔2〕。二苯乙烯苷(TSG)是何首乌的主要有效成分。本研究利用膜片钳技术研究TSG对海马L型钙离子通道的影响，试图从离子通道水平解释何首乌对AD影响的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康Wistar大鼠〔购自长春高新医学动物实验研究中心，合格证号:SCXK-(吉)2003-0004)〕，体重200 g左右。

1.2 主要试剂与仪器 NVSLM1型振动切片机(Campden，英国);电极拉制仪(P-97，美国);倒置相差显微镜(Nikon，日本);膜片钳系统(Axon，美国);Pronase E(Sigma公司，美国);Axopatch200-A放大器(Axon InstrumentsCA，美国);Aβ1-40(Sigma公司，美国);TSG(黑龙江省药材公司)。

1.3 溶液 人工脑脊液(ACSF，mmol/L):NaCl 124，KCl 3，CaCl22，MgCl22，NaH2PO41.23，NaHCO326和 Glucose 10;切片液(mmol/L):KCl 2.5，NaH2PO41.25，MgCl26，CaCl21，sucrose 220，NaHCO326，Glucose 10。在电流钳模式下，记录钙电流的电极内液(mmol/L):K2SO460，NMG 60，HEPES 40，MgCl24，BAPTA 0.5，Phosphocreatine 12，Na2ATP 2，Na3GTP 0.2，用KOH将pH值调至7.2。在电压钳模式，记录钙电流的电极内液(mmol/L):KCl 140、MgCl20.5、EGTA 2、HEPES 5、K2ATP;记录电压依赖性钙电流的细胞外液(mmol/L):NaCl 150，KCl 5，MgCl21.1，CaCl22.5，HEPES 10，Glucose 10，TTX 0.001，用NaOH调pH为7.4。

1.4 方法

1.4.1 海马锥体神经元的制备 取200 g左右的Wistar大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射，待麻醉生效后，剪开胸腔，暴露心脏，夹闭下腔静脉，使用0℃切片液进行心脏灌注。待灌流液体颜色较淡结束灌注，断头，取出全脑，置入0℃切片液(提前30 min经95%O2+5%CO2混合气饱和)中冰镇3 min，分离出海马，以350 μm 的厚度进行切片〔3，4〕。……