炭疽杆菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

谭维国，陈文琦，吕 恒，刘 玉，王 平，陈凤娟，王长军，张锦海

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

炭疽杆菌能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病，严重威胁公众财产、健康和生命安全，并且可形成气溶胶通过空气飞沫传播，易引发突发公共卫生事件，也常常被视为首选的生物恐怖/生物战病原［1-2］。目前的炭疽杆菌检测方法，主要基于对病原体的培养、染色镜检、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些方法均不适合早期快速侦检，难以适应战时疫情控制的需要［3-4］。本研究选择了炭疽杆菌PX01质粒的保护性抗原PA基因、PX02质粒的荚膜合成相关基因capA基因作为检测靶基因，从而建立了一种双重实时荧光定量PCR的方法，能区分强毒株、弱毒株或无毒株，对于应对突发传染病疫情和流行病学调查、突发公共卫生事件应急处置的早期检测、及反生物恐怖袭击预警等具有重要的意义，并已应用在某次重大保障活动中。

1 材料与方法

1.1 材料 ①菌株和质粒:炭疽杆菌强毒株(军事医学科学院五所微检中心);大肠埃希菌XL10-Gold株(美国Stratagene公司);线性化质粒载体pGEM-T easy(美国Promega公司)。②主要试剂:DNA提取液(25 mM NaOH、10 mM Tris-HCl、1%Triton X-100、1%NP-40、0.1mM EDTA、2%Chelex-100)、Pyrobest Taq DNA聚合酶、DNA连接酶、DNAMarker DL2000、DNA纯化及片段回收、抽提质粒试剂盒、RNase H酶TliRNase H II、Taq DNA聚合酶Ex Taq HS等，均为TaKaRa公司(大连)产品;细菌DNA抽提试剂盒(北京天根公司)。③主要设备:ABI 7500 Fast型实时荧光定量 PCR仪(美国 ABI公司，配套软件SDS2.04)。

1.2 方法

1.2.1 引物、探针的设计 通过分别对NCBIGen-Bank中的炭疽杆菌的PA基因和capA基因序列，使用Beacon Designer等多种生物学软件，结合经验判断和人工比对、修正，进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的核苷酸区域，各设计一对引物和探针。……