华北八宝组织培养与再生体系的建立

张璐，王俊丽，王珏，田璧瑞，马林喜

（中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081）

华北八宝（Hylotelephiumtatarinowii（Maxim.）H.Ohba），又称华北景天，是景天科八宝属的多年生草本植物.花期7～8月，果期9月.分布于内蒙古、河北、山西等地，生于海拔1 000～3 000m处山地石缝中.常见于向阳山石上［1］.

华北八宝属于中国的名贵香草植物，可用于精油香料的提取、疾病的防治等［2］.该植物为多肉多浆耐旱花卉，株型小巧，花朵繁茂，可作为耐旱盆栽花卉用于城市园林绿化，并且已被录入中国第6批植物新品种保护名录［3－4］.

根据文献报道，八宝属植物大多具有药用价值，例如，八宝、轮叶八宝、珠芽八宝、白八宝、狭穗八宝、紫花八宝［5－6］等植物具有祛风清热、散瘀消肿、消炎止血等功效.由于华北八宝分布海拔较高，在低海拔地区繁殖难度大，目前可利用的野生资源较少.为了进一步扩大种源，可以采用组织培养的方法，建立华北八宝的快速高效再生体系.目前已有多种植物通过组织培养技术建立了其再生体系，如半夏［7］、新疆雪莲［8］、胭脂花［9］等.

本研究的目的在于以野生华北八宝植株为材料，建立组织培养再生体系，为华北八宝的进一步开发利用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 植物材料的选取与消毒处理

华北八宝野生植株采自北京灵山海拔2 300m的石缝间.选取其幼嫩叶片作为外植体，将幼嫩叶片小心取下，用洗涤灵清洗干净之后在流水下冲洗2h，用体积分数为70%的酒精浸泡30s，再浸于质量分数为0.1%的HgCl2中（加吐温2滴）消毒12min，用无菌水冲洗3～4次.

1.2 培养基及培养方法

以MS培养基为基本培养基，添加质量分数为3%的蔗糖和1%的琼脂粉（pH 5.8），121℃高压灭菌20min.

1.2.1 愈伤组织的诱导

在MS培养基中分别加入不同质量浓度的2，4－D（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L）与6－BA（0，0.5，1.0，2.0mg／L）2种植物生长调节剂，以幼嫩叶片为外植体进行愈伤组织的诱导.

将消毒后的幼嫩叶片切成0.3cm×0.5cm的小块，并用刀片在叶面上刻伤，接种于已经过121℃高压灭菌20min后的培养基中，每瓶接种7块，9瓶为一个处理，重复3次，30d后观察统计愈伤组织诱导率.

1.2.2 不定芽的分化诱导

以MS为基本培养基，加入不同质量浓度的6－BA（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L），TDZ（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L），NAA（0，0.5，1.0，2.0，4.0mg／L），以生长旺盛的愈伤组织为材料进行不定芽的分化诱导.

将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，每瓶接种7块，9瓶为一个处理，重复3次，30d后观察统计不定芽诱导率.

1.2.3 生根培养

分别在MS，1／2MS 2种培养基中进行生根培养.将长到2～3cm的不定芽取出，接于增殖培养基6－BA 1.0mg／L中.20d后将长到3～4cm的不定芽接于生根培养基中，每瓶接种数为6个，9瓶为一个处理，重复3次，30d后观察统计生根率.

1.2.4 炼苗与移栽

选取已生根且植株健壮的再生苗，移栽前先打开瓶盖，在散射光条件下炼苗3d，之后用镊子轻轻取出幼苗，先将幼苗根部的培养基用清水冲洗干净，然后将幼苗移栽到珍珠岩∶营养土∶蛭石＝1∶2∶1（体积比）的培养土中.移栽后浇透水，之后保持适当的温度、湿度和光照.移栽15d后统计成活率.

1.2.5 培养条件

培养室温度为（25±2）℃，光照时间为12h／d，光照强度为40μmol／（m2·s）.

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导

研究发现，培养基中添加单一植物生长调节剂时，愈伤组织的诱导效果均不好.当2，4－D质量浓度为2.0mg／L时诱导率最高为23.81%（表1）；6－BA质量浓度为1.0mg／L时诱导率最高为12.56%（表2）.在含有不同质量浓度2，4－D和6－BA组合的培养基中愈伤组织诱导率较高，以培养基MS＋2，4－D 2.0mg／L＋6－BA 0.5mg／L中的愈伤组织诱导率最高，达到了92.06%（表3），并且愈伤组织状态良好，黄绿色较疏松，生长旺盛（图1）.

表1 2，4－D对华北八宝愈伤组织诱导率的影响Tab.1 Effect of 2，4－D on induction rates of the callus of Hylotelephium tatarinowii

表2 6－BA对华北八宝愈伤组织诱导率的影响Tab.2 Effect of 6－BA on induction rates of the callus of Hylotelephium tatarinowii

数据以±s表示，P＜0.05，标有相同字母的数据表示差异不显著，标有不同字母的数据表示差异显著.

表3 6－BA和2，4－D组合对愈伤组织诱导率的影响Tab.3 Effects of different mass concentrations of 6－BA and 2，4－D on callus induction rates

图1 2，4－D与6－BA配合对叶片愈伤组织的诱导效应Fig.1 Effects of 2，4－D in combination with 6－BA on callus induction

2.2 不定芽的诱导

2.2.1 TDZ与6－BA组合对不定芽分化的影响

在含有不同质量浓度的TDZ或不同质量浓度配比的TDZ与6－BA组合的不定芽诱导培养基中，均未有不定芽的分化，部分愈伤组织呈现嫩绿色且有所增殖，部分愈伤组织褐化或死亡.因此这类培养基组合不适合华北八宝不定芽的分化培养.

2.2.2 TDZ与NAA组合对不定芽分化的影响

在含有不同质量浓度配比的TDZ与NAA的不定芽诱导培养基中，也均未有不定芽的分化，且未分化的愈伤组织部分褐变或死亡.因此这类培养基组合同样不适合华北八宝不定芽的分化培养.

2.2.3 6－BA与NAA组合对不定芽分化的影响

在含有不同质量浓度的6－BA或不同质量浓度配比的6－BA与NAA组合的不定芽诱导培养基中，均有不定芽的分化.愈伤组织在接入含6－BA与NAA的不定芽诱导培养基后，10d内体积有所增大，颜色加深，15d后开始出现绿色小突起，20～25d时，部分愈伤组织开始丛生不定芽（图2）.在MS＋6－BA 1.0mg／L培养基中不定芽的诱导率最高，达到81.52%（表4）.

图2 愈伤组织分化不定芽Fig.2 Adventitious bud induced from callus

表4 愈伤组织不定芽诱导率Tab.4 Adventitious bud induction rates

2.3 生根培养

不定芽在MS和1／2MS 2种培养基中进行诱导培养，10d后，开始生出白色细根，最长可达到3～4cm，成辐射状分布.培养30d后，2种培养基的生根率均可达到100%.1／2MS培养基中每个植株的平均根条数可达到5.9条，而MS培养基中的平均根条数为4.0条（图3）.

图3 再生苗Fig.3 Regenerated plants

2.4 炼苗与移栽

生根苗炼苗移栽后，植株生长良好，15d后统计，移栽成活率可达95%以上.

3 讨论

本研究发现，在培养基中单独附加2，4－D或6－BA，对愈伤组织的诱导效果均不显著，而质量浓度低于4.0mg／L的2，4－D和6－BA配合使用时，愈伤组织的诱导率明显提高.在加入2，4－D和6－BA不同质量浓度组合的培养基中，若2，4－D质量浓度低于6－BA或与之相同时，叶片膨大表现得较为明显，并且诱导出的愈伤组织为深绿色且较致密.而在2，4－D质量浓度高于6－BA质量浓度时，叶片膨大现象不明显，诱导出的愈伤组织为浅黄绿色且较疏松.较高质量浓度的2，4－D（4.0mg／L）不利于愈伤组织的诱导.MS＋2，4－D 2.0mg／L＋6－BA 0.5mg／L培养基的愈伤组织诱导率最高，达到了92.06%.王俊丽等［10］在对华北大黄愈伤组织诱导研究中发现，当不同质量浓度的6－BA分别与低质量浓度2，4－D配合使用时，对愈伤组织的增殖效应十分明显，其中MS＋6－BA 2.0mg／L＋2，4－D 0.2mg／L培养基的增殖效果较好，这与本研究的结果不尽相同.

此外，本研究还发现，6－BA是影响不定芽分化的关键因素，在培养基中单独添加不同质量浓度的6－BA或不同质量浓度配比的6－BA与NAA组合，均可诱导不定芽的分化.这与文献所报道的细胞分裂素对组织培养中不定芽的分化及增殖有着显著作用结论［11－12］相一致.张晓艳等［13］研究了影响八宝景天愈伤组织诱导、芽诱导、生根的主要因素，发现八宝景天叶片切块诱导愈伤组织的最佳培养基为MS＋6－BA 2.0mg／L＋NAA 1.0mg／L，诱导率达93.3%；MS＋6－BA 2mg／L＋NAA 0.1mg／L培养基有利于芽的分化和增殖.任爽英等［14］研究也发现，培养基中添加6－BA时对八宝景天不定芽的分化有促进作用.上述研究与本研究结果相一致.

本研究以华北八宝幼嫩叶片为外植体建立了其组织培养再生体系，这对野生华北八宝的开发与利用有着重要意义.

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