探索应用于膜片钳研究的脑片制备方法

刘志洋，王会芳，何海斌，刘 娜，王金萍，彭 雪，王子真，高俊涛 (吉林医药学院，吉林吉林 132013)

有关脑片膜片钳技术最早可追溯至1985年，美国的Gray和Johnston采用酶解撕裂法对豚鼠海马脑片GABA受体通道进行了研究。而将膜片钳技术成熟地应用于离体脑片神经元则是1989年，德国马普研究所Edwards、Sakmann和日本京都大学Takahashi首次将微分干涉相差技术应用到膜片钳技术领域，并对大鼠(海马，视皮层，嗅球，小脑，额叶皮层和脊髓等)、小鼠(海马)、猫(视皮层)神经元离子通道特点进行了广泛研究。近年来随着膜片钳技术的日益成熟，利用脑片研究神经细胞的电生理活动具有其独特的优势。其可以保留较完整的纤维联系与空间结构，同时又能排除在体内复杂的因素对其影响，使得研究变得简单化［1-2］。因此脑片在研究神经病、癫痫、电生理反应、微管相关蛋白tau表达及在各种条件下损伤程度等实验中有重要的应用，脑片培养技术十分重要，脑片的制取和培养也越来越突出了它的重要性［3］。目前，国内已经开始发展幼鼠海马脑片的技术，但可能因为各种不适条件或方法的不同［4］而产生误差甚至是失败，本文详细介绍一种幼鼠脑片的制备步骤及制备的过程以及可能遇到并需要注意的问题。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新生1～2 d的Wistar乳大鼠由吉林医药学院实验动物中心提供。

1.2 试剂

人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol/L):NaCl 126，KCl 3.0，KH2PO41.2，NaHCO326，CaCl22.5，MgCl23.3。(每 250 mL ACSF用量:10×Stock 25 mL;ddWater 225 mL;CaCl2600 μL;MgCl2325 μL);葡萄糖 0.45 g(pH 7.4)。

Cutting solution pH 7.4成分(g/L):Choline chlofide 167.5;KCl 1.94;CaCl275μL;MgCl21 050 μL;NaHCO321.8;NaH2PO41.5;Glucose 27;A-scorbate acid 25.7(每150 mL Cutting solution用量:10 × Stock 15 mL;ddwater 135 mL;CaCl275 μL;MgCl21 050 μL;Glucose 0.405 g;Ascorbate acid 0.039 g)。瞬间粘合剂(Loctite 404TM胶);振动切片机(MA752 Motorised Advance Viborslice UK);脑片孵育槽;恒温水浴锅。

1.3 切片方法

将5%的琼脂……