缺氮条件对栅藻油脂积累与光合作用的影响

刘金丽 , 王俊峰, 刘天中, 高莉丽

(1. 中国海洋大学 食品科学与工程学院, 山东 青岛 266003; 2. 中国科学院 青岛生物能源与过程研究所,中国科学院 生物燃料重点实验室, 山东 青岛 266101)

近年来, 可再生能源的研发在全球范围形成持续热潮。利用微藻生产生物柴油具有不与人争粮、不与粮争地、不与粮争水、副产物价值高等优势, 是重要的液体燃料替代形式[1-2]。在适宜条件下, 产油微藻通常处于营养生长状态, 细胞内脂质含量较低,且多为极性脂(polar lipid), 如磷脂(phospholipid); 而在胁迫条件下, 细胞内很快积累大量中性脂(neutral lipid), 如甘油三脂(triacylglycerol, TAG)。这期间细胞所经历的生理生化变化是近年来研究的热点。如Li等[3-4]发现抑制莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的淀粉合成途径会提高油脂含量, 表明在衣藻中脂肪代谢与糖代谢密切相关。Chen等[5]发现微拟球藻(Nannochloropsis)的脂肪酸组成与初始细胞接种量密切相关, 接种细胞浓度较低时中性脂含量高, 而接种浓度较高时极性脂含量较高, 表明微藻脂肪酸组分可能与细胞所处光环境有关。Cakmak等[6]发现缺氮或缺硫都可以提高衣藻的TAG含量。Recht等[7]发现缺氮条件下雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和微拟球藻均会大量积累油脂, 但它们的糖-脂比例存在不同的变化模式。

栅藻(Scenedesmus dimorphus)属绿藻门(Chlorophyta)、绿球藻目(Chlorococcales), 是一种常见的淡水微藻, 广泛分布于湖泊、池塘、沼泽等静水生境。栅藻是研究水体环境、水体污染、光合作用的常用材料。同时, 由于其生长快速、能大量合成油脂, 是典型的产油微藻[8]。栅藻对环境的适应性强,耐污染能力强[9], 甚至能在污水、城市生活废水中生长[10], 这一特性使其在规模化培养方面较其他微藻更具优势。有学者研究了栅藻合成虾青素过程的色素组成和光合作用的变化[11-13], 但关于其油脂积累过程的报道还较少。深入了解栅藻的产油过程将有助于推进利用栅藻生产微藻柴油的研究和应用。本研究利用栅藻(Scenedesmusdimorphus)为实验材料,考察了缺氮条件下栅藻的油脂含量和组分变化以及光合作用的改变。

1 材料与方法

1.1 藻种与培养基

本实验所用栅藻(Scenedesmus dimorphus)来自中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 所用培养基为 BG11[14]。栅藻油脂诱导过程采用不含硝酸钠(NaNO3)的缺氮 BG11培养基, 其他组分及含量均不变, 对照组为完全BG11培养基培养。

1.2 反应器与培养方法

本实验所用反应器为玻璃柱式反应器, 内直径0.05 m, 柱高0.55 m, 工作体积0.9 L。柱式反应器内部有一直径 5 mm的玻璃通气管。混合有 1.5%CO2(V/V)的压缩空气(0.1 MPa)以0.1 vvm的速率通过通气管从反应器底部鼓泡, 从而将藻液搅动并补充碳源。培养过程中连续照光, 培养柱表面光强100 μmol/(m2·s)。培养温度25°C, 培养过程中pH维持在7.0～8.0。对照组(完全BG11)和实验组(缺氮BG11)各培养5支柱子, 测定其中的3支, 记为3个重复。

1.3 生长测定

用质量分析方法测定藻液生物量浓度。将孔径0.45 μm, 直径 50 mm的混合纤维素滤膜(上海兴亚净化材料厂, 上海)煮沸3次, 并于105℃热风干燥24 h后称重。将一定体积的藻液过滤于滤膜上, 并用3倍体积的去离子水冲洗 3次, 以去掉附着在细胞表面的盐分, 105 °C热风干燥24 h后再次称重。根据两次质量之差计算出藻液生物量浓度。

叶绿素及类胡萝卜素含量参照甲醇提取叶绿素[15]的方法。测定甲醇提取液在666 nm, 653 nm, 470 nm下的OD值。根据以下公式分别计算叶绿素a(Chla), 叶绿素b(Chlb), 类胡萝卜素(Car)的含量:

1.4 电镜观察

1.4.1 扫描电镜(Scanning electron microscopy,SEM)

取少量藻液于1.5 mLEP管中离心(5 000 g, 30 s),去上清, 双蒸水清洗藻渣3次。加入1 mL的2.5%戊二醛固定2 h, 然后加1.5 mL磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗3次, 每次10 min。加1%锇酸固定1 h。固定完后,依次用10%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%(V/V)乙醇脱水, 每个梯度15 min。再浸入100%乙醇脱水2次, 每次 10 min, 然后浸入 1:1(V/V)的乙醇-叔丁醇混合液中15 min, 再浸入100%叔丁醇中2次, 每次15 min,最后冷冻干燥。用导电胶带粘于样品台, 喷金后观察SEM图像。

1.4.2 透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)

取样固定步骤同 1.4.1。固定后样品用磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗 2 h, 然后依次用 10%, 30%, 50%,70%, 80%, 90%丙酮脱水, 每个梯度15 min。之后浸入100%丙酮中3次, 每次10 min。然后浸入丙酮与Epon812树脂混合液(V∶V= 7:3)中5 h, 再浸入丙酮与Epon812树脂混合液(V∶V= 3:7)中过夜。最后纯Epon812树脂中浸没5 h并聚合硬化成包埋块, 超薄切片机切片, 2%醋酸双氧铀染色20 min后观察TEM图像。

1.5 油脂含量及组分分析

将藻液离心收集后(5 000g, 30 s), 藻细胞真空冷冻干燥后研磨成干粉, 依据有机溶剂氯仿-甲醇提取方法[16]提取藻细胞中的总脂并称重定量。

分析油脂组分及含量用棒状薄层色谱法(TLC/FID)来测定。将提取的油脂用氯仿溶解, 取1 μL分4～5次点样在棒状薄层色谱柱上, 先后在两种展开剂中展开。展开剂Ⅰ:苯:氯仿:乙酸 = 50:20:0.75 (V/V),展开剂Ⅱ:苯:己烷 = 1:1 (V/V)。将分离开来的脂质成分出峰时间与标准样品相对比, 确定其组成及相对含量。分析过程中的条件控制: 空气流 2 L/min , 氢气流0.16 L/min。

1.6 光合放氧速率的测定

使用 Chlorolab-2液相氧电极(Hansatech, 英国)测定栅藻细胞在不同光强(PFD)下的放氧速率。将藻液离心后(5 000g, 30 s)沉淀用含有50 mmol/L NaHCO3的含氮或无氮BG11重新悬浮, 调整悬浮液叶绿素浓度至10 mg/L。将1 mL悬浮液加入反应杯中, 通入纯氮气1 min赶走溶解氧, 打开光源记录放氧速率。通过加减遮光片数量改变入射光强, 设置的光强梯度为: 400, 200, 100, 80, 60, 40, 20, 0 μmol/(m2·s)。每个光强测定3次, 每次测定前更换新藻液。根据叶子飘和李进省[17]和 Ye[18]的方法拟合 PFD-放氧速率曲线, 并计算暗呼吸速率(Rd)、最大放氧速率 (Pmax)、光补偿点 (LCP)和光饱和点 (LSP)。

1.7 叶绿素荧光的测定

使用Imaging-PAM (Walz, 德国)测定栅藻的最大光化学效率 (Fv/Fm)和非光化淬灭系数(Non-photochemical quenching co-efficiency, NPQ)。将藻液过滤与孔径0.45 μm的混合纤维素滤膜上, 然后置于用含50 mmol/L NaHCO3的含氮或无氮BG11培养基润湿的滤纸上。将滤纸连同滤膜一起置于荧光仪CCD摄像头下暗适应15 min。打开测量光, 测定初始荧光 (F0), 然后加饱和脉冲光 (10 000 μmol/(m2·s)),测定最大荧光 (Fm), 之后打开活化光 (100 μmol/(m2·s))。待荧光值稳定后再加一次饱和闪光, 测定实际最大荧光 (Fm’)。按照如下公式计算相关参数[19]:

1.8 统计分析

使用 spss10.0对实验组与对照组做t检验, 当P＜0.05时认为两者存在显著差异。图中数据为3次重复的平均值±标准差。

2 结果

2.1 缺氮处理对栅藻生长的影响

电镜结果如图1所示, 其中(a)～(c)是扫描电镜结果, 标尺=3 μm; (d)～(f)是透射电镜结果, 标尺=1 μm;(a)和(d)是接种初始时结果; (b)和(e)是对照组(高氮)培养10 d的结果; (c)和(f)是缺氮培养10 d的结果; (g)是(d)图框定区域的放大, 标尺=0.5 μm。SG表示淀粉粒; TL表示类囊体; LB表示脂肪体。实验开始时栅藻细胞呈梭形, 并以四连体形式存在(图1a), 细胞内可见淀粉粒被类囊体膜包裹, 无脂肪体(图1d, g)。缺氮处理 10 d后, 栅藻细胞四连体解体, 直径明显增大(图1c), 细胞壁明显加厚, 细胞内部大量空间被脂肪滴和淀粉粒填充(图1f)。高氮条件下(对照组)生长10 d后细胞形态与初始时变化不大(图1b), 但细胞壁明显加厚, 淀粉粒明显增多(图1e)。

图1 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)细胞形态和结构的影响Fig.1 The effect of nitrogen starvation on the morphology and structure of the Scenedesmus dimorphus

缺氮处理的生物量积累与对照组在前 4 d差别不大(P＞0.05), 4 d后缺氮处理生物量积累速率减慢并显著低于对照组(P＜0.05)。对照组10 d内生物量增加到(5.8 ± 0.03)g/L, 而缺氮处理组为(4.1 ± 0.04)g/L(图 2)。

图2 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)生长的影响Fig.2 The effect of nitrogen starvation on the biomass accumulation of the Scenedesmus dimorphus

随着培养时间延长, 对照组和处理组的单位干重叶绿素和类胡萝卜素含量都降低, 但缺氮处理降低的更快(图3a, 图3b)。与对照组相比, 缺氮处理组的类胡萝卜素/叶绿素含量比值在培养过程中逐渐升高并一直显著高于对照组(P＜0.05; 图3c)。对照组与处理组的叶绿素 a/叶绿素 b含量比值差别不大并一直维持在2.2～3.1之间(图3d)。

图3 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)叶绿素和类胡萝卜素积累的影响Fig.3 The effect of nitrogen starvation on the accumulation of chlorophyll and carotenoid in the Scenedesmus dimorphus

2.2 缺氮处理对栅藻油脂积累和油脂组分的影响

未经缺氮处理的栅藻细胞总脂含量占干重的(22.4 ± 0.6)%, 其中总脂的(92.8 ± 1.6)%为磷脂(PL),中性脂(TAG)只占(4.6 ± 1.2)%(图4)。缺氮处理后栅藻总脂含量逐渐升高, 13 d后总脂含量升高到(36.3 ± 0.7)%(图 4), 显著高于(P＜0.05)对照组的(30.1 ± 0.7)%; 其中 TAG 含量升高到(68.3 ± 2.5)%(图4), 显著高于(P＜0.05)对照组的(37.0 ± 0.1)%; PL 含量降低到(26.8 ± 2.0)%(图 4), 显著低于(P＜0.05)对照组的(55.7 ± 2.4)%。

图4 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)总脂含量和总脂组分的影响Fig.4 The effect of nitrogen starvation on the total lipid content and lipid components of the Scenedesmus dimorphus

2.3 缺氮处理对栅藻光合作用的影响

缺氮处理使栅藻的暗呼吸速率(Rd)和光补偿点(LCP)迅速升高, 而对照组在实验过程中维持稳定(图5a, d)。随着培养时间的延长, 缺氮处理组和对照组的最大放氧速率(Pmax)都逐渐降低, 至实验结束时分别为(37.6 ± 3.6)μmol O2/ mgchl·h 和(75.4 ± 6.4)μmolO2/ (mgchl·h)(图 5b)。实验开始时, 栅藻的光饱和点(LSP)为(198.2 ± 6.8)μmol/(m2·s), 之后实验组和对照组均降低, 到第 13 天时, 缺氮处理组降低到(94.4 ± 2.1)μmol/(m2·s), 而对照组降低到 (119.7 ±1.6)μmol/(m2·s)(图 5c)。

培养过程中, 对照组的最大光化学效率(Fv/Fm)和非光化学猝灭系数(NPQ)基本维持稳定。缺氮处理1 d后栅藻Fv/Fm即明显低于对照组, 但前 4 d内Fv/Fm一直维持在较高水平(＞0.6), 之后开始逐渐下降, 到第10 天时已降至0.4 ± 0.01; 而NPQ在前3 d内较低且维持稳定, 从第 4 天开始逐步升高, 到第10 天时以升高到1.5 ± 0.01, 是初始时的1.8倍(图6)。

图5 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)光合放氧参数的影响Fig.5 The effect of nitrogen starvation on the photosynthetic oxygen evolution of the Scenedesmus dimorphus

图6 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)最大光化学效率(Fv/Fm)和非光化学猝灭系数(NPQ)的影响Fig.6 The effect of nitrogen starvation on the maximum photo-chemical efficiency (Fv/Fm)and non-photochemical quenching co-efficiency (NPQ)of Scenedesmus dimorphus

3 讨论

三脂酰甘油(TAG)是优质的生物能源原料。经过酯化反应, TAG中的脂肪酸链可以转化成能完全替代普通柴油的高热值、低污染的生物柴油, 而剩余的甘油骨架既是重要的工业原料, 也可以通过进一步加氢转化成生物乙醇[20]。本研究发现培养13 d后, 栅藻的总脂含量达到干重的 36%, 显著高于油料作物大豆的平均水平[21]。这一值与雨生红球藻(Haematococcus)的含油量接近[7]而低于微拟球藻(Nannochloropsis)[5]。高含油量, 特别是高中性脂含量是微藻作为生物柴油原料来源的重要优势。目前,关于微藻脂肪代谢, 特别是胁迫条件下 TAG的积累过程的研究尚不充分[21]。本研究发现缺氮条件下, 随着TAG含量的升高, 磷脂含量出现相应的下降(图4),同时细胞内部的膜结构也逐渐减少(图1f)。据此推测栅藻细胞内部可能存在将磷脂转化成TAG的机制。例如, 通过磷脂二脂酰甘油酰基转移酶(Phospholipid diacylglycerol acyltransferase, PDAT)的磷脂代谢途径。在高等植物中PDAT途径广泛存在, 而在微藻中只存在于少数种类[22-23], 而栅藻中尚未见报道。此外,胁迫条件下微藻细胞碳源的分配问题一直不太清楚。Li等[3-4]发现抑制衣藻的淀粉代谢会导致油脂积累的增加, 说明淀粉合成和油脂合成会竞争碳源。Recht等[7]发现对于雨生红球藻来说在氮缺乏条件下存在由淀粉向 TAG转化的代谢途径, 而在Nannochloropsis中则不存在这样的途径。在本实验中, 缺氮培养 13 d后的栅藻细胞中, 除了大量的脂肪体外, 还存在较多的淀粉粒和较厚的细胞壁(图1f),这说明栅藻的大量合成TAG的过程对糖代谢的影响较小, 胞外碳源直接流向了能量密度较高的脂肪酸合成途径。

营养缺乏(特别是氮源缺乏)结合高光强是诱导微藻合成次生代谢物的常用方法[6-7,24-25]。本研究中,培养用光强为 100 μmol/(m2·s)左右, 这一光强在实验初期远低于 200 μmol/(m2·s)的光饱和点(LSP), 即使在培养后期也仅达到与LSP接近的水平(图 5c),所以栅藻细胞所处的环境只有缺氮胁迫而没有强光胁迫。与对照组相比, 缺氮处理的栅藻细胞最明显的改变是叶绿素含量降低而呼吸速率升高, 而且这些变化十分迅速, 在处理第 1 天即表现出来(图3a, 图5a)。胁迫条件下叶绿素含量快速降低、呼吸速率升高的现象已经被广泛报道[7,11,26], 但多是在强光下(＞300 μmol/(m2·s))或室外(光强＞2 000 μmol/(m2·s)的研究结果。另外, 许多研究表明在胁迫条件下微藻细胞内的类胡萝卜素含量升高[6,11-13], 但是本研究中,缺氮胁迫下栅藻细胞内类胡萝卜素含量实在培养过程中一直在降低(图3b)。这表明类胡萝卜素(虾青素)的合成可能需要强光环境。叶绿素荧光参数Fv/Fm是反映光系统II完整性的重要指标[27]。通常情况下, 经充分暗适应的未受胁迫的绿藻Fv/Fm值在 0.7左右,受到胁迫后该值降低。Parkhill等[28]发现营养盐的缺乏对微藻的Fv/Fm值的影响不明显, 这与本文的结果不同, 我们发现缺氮处理 1d后栅藻Fv/Fm即明显低于对照组。但同时我们也注意到, 在缺氮处理前期栅藻光系统Ⅱ并没有受到严重损伤, 4 d之后光系统Ⅱ的损伤逐步加剧, 类似的情况也表现在最大光合放氧速率(图5b)和NPQ上(图6b)。如果说强光条件下减少叶绿素含量、增大呼吸速率、提高光系统Ⅱ失活反应中心的比例、提高NPQ等改变有助于光合系统减少光能吸收、加快能量耗散, 从而减少过剩激发能产生的伤害[18], 那么非饱和光下的类似变化如何解释？我们给出两种假设: 1)碳同化和氮同化过程是光合作用产生的能量通汇(ATP)和还原力(NADPH)的主要流向[29]。氮源缺乏的时候, ATP和NADPH会相对过剩, 进而导致光合电子传递链激发能的过度积累, 可能会进一步造成光合作用的损伤, 从而需要启动上述机制以保护细胞。2)上述生理学变化与光破坏的防御机制无关, 而是栅藻细胞为了适应缺氮环境, 将自身代谢模式由先前的营养生长主动转换到次生代谢物积累的结果, 可能反映了细胞将暂时无用物质(如氮代谢酶系统)转化为能量储存物质(如TAG)的过程。

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