柯萨奇病毒B5巢式RT-PCR检测方法的建立*

段晶晶，刘国华，黄学勇，李幸乐，王 芳，胡小宁1,，许汴利1,#

1) 郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001 2)郑州市疾病预防控制中心传染病防治科 郑州 450007 3) 河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 郑州 450016 4)郑州市儿童医院感染性疾病科 郑州 450053

近年来，河南省暴发多起病毒性脑炎，经检测主要由柯萨奇病毒B5(coxsackie virus B5, CVB5)引起[1]。CVB5是一种常见的能引起病毒性脑炎的肠道病毒，属于肠道病毒属小核糖核酸病毒，无包膜，单股正链RNA[2]，其引起的病毒性脑炎在我国广泛存在[3-4]。病毒的分离培养与PCR扩增测序是鉴定CVB5的主要方法和金标准，但由于该方法的敏感性和检出率低、耗时长且费用高，临床上极少采用[5]，探索简单、快速、灵敏度高的CVB5检测方法非常有必要，为此，作者建立了检测CVB5的巢式RT-PCR方法，报道如下。

1 材料与方法

1.1毒株、试剂与仪器CVB5、Echo6、Echo25、EV71、CVA16毒株由河南省疾病预防控制中心传染病所实验室分离培养和保存。52份(血清16份，粪便19份，脑脊液17份)样本采自临床确诊的病毒性脑炎病例。RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)；RT-PCR试剂盒和PCR反应液(TaKaRa公司)，PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪(BIO-RAD公司)。

1.2引物设计与合成从GenBank下载CVB5河南分离株全基因序列，进行保守性分析，根据引物设计原则，在VP1区设计巢式PCR引物，包括外引物P1：5’-GTGGAGAGGGCCATTGCACGCGTCG-3’，P2：5’-CAGTCACGCCAGTAGGTTCAAAAT-3’，预期扩增产物大小约800 bp；内引物P3：5’-TATGATGGGT GGGCTAGGTT-3’，P4：5’-TCTGTCACGCCAGTAGGT TC-3’，预期扩增产物大小约200 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3标本RNA的提取与反转录按照RNA提取试剂盒说明书的操作步骤提取所有样本RNA后，在Microtube管中加入dNTP Mixture和Random 6 mers各1 μL，已提取的RNA 2 μL，再加入RNase Free dH2O至终反应体系为10 μL， PCR仪上65 ℃ 5 min进行变性、退火。产物离心数秒后在该EP管中加入Prime ScriptTMBuffer 4 μL，RNase Inhibitor和Prime ScriptTMRTase各0.5 μL，RNase Free dH2O 5 μL，配置成20 μL反应体系。反转录PCR反应条件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。

1.4巢式PCR反应条件的优化PCR反应总体系为50 μL，每次反应保持其他3个条件不变，分别以cDNA 模板梯度0.5、1.0、1.5、2.0 μL，上下游引物(25 μmol/L)梯度0.4、0.8、1.0、1.2、1.6 μL，退火温度梯度50 ℃、53 ℃、56 ℃、59 ℃、62 ℃，循环数20、25、30、35个梯度循环进行PCR反应，将产物进行琼脂糖凝胶电泳后观察成像结果，确定最适模板量、最佳引物量、最适退火温度和最佳循环数。

1.5产物的检测和鉴定取PCR反应产物8 μL，用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳(180 V，30 min)。根据DNA Marker(DL2000)、阳性对照和阴性对照判定结果，使用凝胶成像系统记录结果。PCR反应结果为阳性者委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，用Blast程序进行同源性鉴定。

1.6巢式RT-PCR的评价及临床应用①特异性：选用已经过鉴定的5株不同的CVB5毒株和4株其他肠道病毒毒株(包括Echo6、Echo25、EV71、CVA16)及阴性对照(H2O)，用所建立的方法进行扩增，以验证该方法的特异性。②敏感性：选用RD细胞进行病毒效价滴定，得到CVB5标准株病毒浓度为6.32×107TCID50mL-1后，以其为标准进行10倍连续稀释，分别得到1 000 TCID50，100 TCID50，10 TCID50，1 TCID50，10-1～10-9TCID50，用已建立的方法进行扩增，取产物8 μL进行琼脂糖凝胶电泳，以确定其敏感性。③重复性：将CVB5、Echo25、EV71等不同毒株及10份病毒性脑炎病例样本分别用已建立的检测方法重复实验3次,以判断其重复性。对52个临床标本进行检测时，分别以CVB5标准株和无菌水作为阳性和阴性对照。

2 结果

2.1巢式RT-PCR反应体系和反应条件优化结果

最终确定2轮PCR扩增反应总体系均为50 μL，包括PCR反应液25 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、RNase Free dH2O 22 μL。在第2轮扩增反应中，取第1轮PCR扩增产物1 μL作为第2轮的反应模板。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。第2轮反应条件除了将第1轮的30个循环改为25个循环外，其他与第1轮相同。

2.2扩增产物的鉴定CVB5经2轮扩增，结果显示第1轮扩增产物位于800 bp条带处，第2轮扩增产物位于200 bp条带处，且第2轮与第1轮相比条带更加清晰，见图1。测序及同源性分析结果显示核苷酸同源性为100%，证明该扩增产物的确是CVB5的VP1区基因片段。

2.3巢式RT-PCR的特异性第1轮扩增，5株CVB5毒株均出现800 bp的目的条带，且条带清晰可见，无其他杂带，而Echo6、Echo25、EV71、CVA16及阴性对照均无目的条带，见图2。第2轮扩增，5株CVB5毒株在200 bp处均出现目的条带，而其余4株病毒及阴性对照未见目的条带，见图3。结果与预期一致，证明该方法对CVB5毒株具有高度特异性。

图1 2轮PCR反应的电泳结果

图2 特异性实验第1轮扩增结果

图3 特异性实验第2轮扩增结果

2.4巢式RT-PCR的敏感性第1轮PCR反应的敏感性达到10 TCID50，见图4。第2轮PCR反应敏感性达到10-4TCID50，见图5。

2.5巢式RT-PCR的重复性分别用已建立的检测方法对CVB5、Echo25、EV71等不同毒株及10份病毒性脑炎病例样本重复测定3次，所有结果均一致。

2.6临床样品检测结果对52份病毒性脑炎样本用所建立的巢式RT-PCR方法进行扩增，其中有10份为阳性，阳性率为19.23%，分别为血清4份(4/16)、粪便3份(3/19)、脑脊液3份(3/17)，经测序鉴定全部为CVB5。而用病毒分离VP1测序方法得到阳性仅6份，分别为血清2份、粪便3份、脑脊液1份，且均来自于巢式RT-PCR结果为阳性的10份样本。

图4 灵敏性实验第1轮扩增结果

图5 灵敏性实验第2轮扩增结果

3 讨论

病毒性脑炎是常见的中枢神经系统感染性疾病，严重威胁儿童的身心健康，临床上主要由医生根据患儿的症状体征、脑脊液和脑电图检查等进行确诊，但无法得到病原学诊断。病毒的分离培养是目前鉴定CVB5的金标准，但该方法存在操作繁琐、耗费时间长、病毒分离成功率低等问题[6]。PCR作为一种新的分子生物学检测技术，具有操作简单、快速、灵敏度和特异度高、易标准化等特点，已被越来越多地用于肠道病毒的诊断[7]。该研究建立的巢式RT-PCR方法一般在5 h内即能完成包括RNA提取在内的CVB5的检测，在采集当天即可以出结果，从而节约了大量的时间、人力和物力，降低了经济成本。初步研究结果也显示其特异性强，灵敏度达到10-4TCID50，且重复性好。用建立的巢式RT-PCR方法对临床52份不同的病毒性脑炎样本进行检测，结果阳性的10份样本经测序鉴定全部为CVB5，而病毒分离方法仅显示6份阳性(均来自已检测为阳性的10份样本)，说明该方法较病毒分离方法具有更高的灵敏度。

综上所述，该研究建立的巢式RT-PCR检测方法具有简单快速、灵敏度和特异度高、重复性好且经济合理等特点，有效地解决了病毒分离方法存在的问题，为CVB5感染的流行病学调查和实验室检测提供了一种更为快速、敏感和可靠的手段。但由于CVB5是RNA病毒，核酸极易降解，同时PCR极易造成标本之间的污染，尤其是2次PCR反应，因此实验操作中要保证标准的PCR操作环境和严格的实验规程，以确保结果的准确性和可靠性。

[1] 黄学勇，许玉玲，李幸乐，等. 柯萨奇病毒B5河南分离株全基因组序列测定及分析[J]. 郑州大学学报:医学版,2011,46(6)：868

[2] 李华，杨卉娟，柯华昕，等.一株柯萨奇病毒B组5型(Cox.B5)病毒的分离及VP1基因分析[J].医学研究杂志，2011,40(9)：55

[3] 胡永峰，赵丽娜，董杰，等．中国萨科奇病毒B5的全基因组测序及其序列分析[J].病毒学报，2010，26(4)：283

[4] 王海岩，李岩，徐爱强，等. 柯萨奇B5病毒引起山东省一起无菌性脑膜炎暴发的鉴定及其亲缘进化分析[J].中华流行病学杂志，2010,31(1)：64

[5] 谢艺红，董柏青.病毒性脑炎研究进展[J]. 应用预防医学，2008,14(6)：382

[6] 沈建峰，蒋就喜. 病毒性脑炎的分子生物学诊断进展[J]. 医学综述，2010, 16(8)：1226

[7] Cheng MF, Chen BC, Huang TS, et al. Clinical application of reverse-transcription polymerase chain reaction and intravenous immunoglobulin for enterovirus encephalitis[J]. Jpn J Infect Dis, 2008，61(1)：18