LC-MS/MS法测定人血浆中苯海拉明血药浓度及其制剂的生物等效性研究

刘世军，曹若明，崔，孙克明，刘宪勇，张 敏，郑慧敏（.武警山东总队医院药剂科，济南5004；.济南市疾病预防控制中心，济南 500；3.山东大学公共卫生学院卫生检验研究所，济南 500）

苯海拉明（Diphenhydramine）为抗组胺药，具有抗组织胺H1受体的作用，对中枢神经有较强的抑制作用，亦有阿托品样作用，适用于皮肤黏膜的过敏性疾病，如荨麻疹、枯草热、过敏性鼻炎等，还可用于预防晕船、晕车、晕飞机等晕动病。本试验拟建立灵敏、准确的高效液相色谱串联质谱电喷雾（LC-MS/MS）法测定苯海拉明在人血浆中的血药浓度，对其在人体内的药动学特性及其生物等效性进行研究。

1 材料

1.1 仪器

API 4000型串联四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）及Analyst 1.4.2数据处理系统（美国Applied Biosystem Sciex公司）；1100高效液相色谱仪，包括G1312 A紫外检测器、G1312 A四元梯度泵、G1313 A自动进样器、G1316 A柱温箱（美国Agilent公司）；AG135电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 药品与试剂

苯海拉明标准品（中国药品生物制品检定研究院，批号：100066-200506，纯度：99.1%）；富马酸氯马斯汀标准品（内标，中国药品生物制品检定研究院，批号：100229-200803，纯度：99.0%）；受试制剂：氨麻苯美片（瑞阳制药有限公司，规格：每片含盐酸苯海拉明25 mg），参比制剂：氨麻苯美片（拜耳医药保健有限公司启东分公司，规格：每片含盐酸苯海拉明25 mg），2种制剂含量差异均在5%之内。乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵为色谱纯，盐酸、二氯甲烷、正己烷、异丙醇为分析纯，水为超纯去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱柱：Inertsil Hilic柱（150mm×3.0mm，5μm）；流动相：乙腈-水（10 mmol/L乙酸铵）-甲酸（40∶60∶1，V/V）；流速：0.3 ml/min；柱温：35℃；离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：多反应监测（MRM），正离子扫描方式；电喷雾电压：4600 V；离子源温度：450℃；气帘气：20 psi；雾化气：50 psi；辅助气：40 psi；用于定量分析的苯海拉明和内标的离子对分别为m/z 256→152和m/z 344→215。

2.2 标准溶液的配制

2.2.1 苯海拉明标准溶液：准确称取苯海拉明标准品10.0 mg，用甲醇配成200 μg/ml的贮备液，并依次稀释得5、50、500 ng/ml的溶液，4℃冷藏备用。

2.2.2 内标溶液：准确称取富马酸氯马斯汀标准品10.0 mg，以甲醇-水混合液为溶剂配成200 μg/ml的贮备液，并依次稀释得10、100、1000 ng/ml的溶液，4℃冷藏备用。

2.3 血样处理

精密量取血浆样品0.2ml，加入甲醇-水（50∶50，V/V）0.1 ml，加入内标（10 ng/ml氯马斯汀）溶液0.1 ml、磷酸缓冲溶液（pH11）0.2 ml，涡旋震荡1 min。再加入提取溶剂（正己烷-二氯甲烷-异丙醇（30∶20∶1，V/V/V）3 ml，涡旋振荡2 min，往复振荡15 min，3000 r/min离心10 min。吸取有机层于另一离心试管中，于35℃水浴上通氮气吹干，残渣用流动相0.1 ml溶解，取5 μL进样分析。

2.4 方法专属性

对照品和内标二级质谱图见图1；高效液相色谱图见图2。结果表明血浆中内源物质无干扰。

图1 二级质谱图A.苯海拉明；B.内标Fig 1 Ms2spectrogramA.diphenhydramine；B.IS

2.5 标准曲线的制备

取多份空白血浆适量，分别加入定量的苯海拉明标准溶液，配制标准曲线系列血浆样品，其中含药物质量浓度为0.5、2.5、12.5、25、50、125 ng/ml；按照“2.3”项下方法处理，采用加权（W＝1/X2）最小二乘法进行线性回归，考察苯海拉明标准品与内标的色谱图峰面积比（y）与相应浓度（x）的相关性。得苯海拉明的直线回归方程为y＝0.264 x+0.0349（r＝0.9965）。结果表明，苯海拉明血药浓度在0.5～125 ng/ml范围内线性关系良好。

图2 高效液相色谱图A.空白血浆；B.苯海拉明标准品+内标；C.空白血浆+苯海拉明标准品+内标；D.受试者血浆样品+内标Fig 2 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.diphenhydramine standard+IS；C.blank plasma+diphenhydramine standard+IS；D.plasma sample of volunteer+IS

2.6 回收率及精密度试验

取低、中、高（1.25、12.5、100.0 ng/ml）3个质量浓度的苯海拉明血浆，按照“2.3”项下方法处理后进样分析。计算准确度（方法回收率）和绝对回收率（n＝5）；同日内测定5次，计算日内RSD；每日测定1次，连续测定5 d，计算日间RSD，结果见表1。

表1 精密度及回收率试验结果（±s，n＝5）Tab 1Results of precision and recovery test（s±s ，n＝5）

表1 精密度及回收率试验结果（±s，n＝5）Tab 1Results of precision and recovery test（s±s ，n＝5）

3.384.502.201.40±0.0512.6±0.699.0±2.21.2512.5100.0，1.33±0.1012.4±0.597.6±5.37.344.105.50101.9±6.3103.4±1.299.4±3.272.7±4.675.3±3.971.9±5.2

2.7 稳定性试验

分别取含苯海拉明低、中、高3个质量浓度的质控样品各5份，测定－20℃冷冻保存14 d、2次冷冻-冻融、室温放置6 h时药物的浓度，考察不同存放条件对苯海拉明稳定性的影响。试验结果显示，苯海拉明在以上存放条件下，质控样本测试结果RSD均＜8%，提示苯海拉明血浆样品在上述条件下保存稳定性较好。

2.8 样品采集与测定

健康男性志愿者20名，体质量（64.7±4.6）kg。于试验前统一体格检查，肝、肾功能正常，且无急、慢性疾病及家族遗传病史。试验前2周内无用药史，3个月内未参加其他新药临床试验，志愿者在试验前2周及试验期内禁烟、酒。试验前签定书面知情同意书，试验方案通过医院医学伦理委员会批准。20名健康志愿者单剂量口服氨麻苯美片受试制剂或参比制剂2片，分别于服药前（0 h）和服药后0.33、0.67、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、14、24、36h时取肘静脉血4ml，肝素抗凝，3500r/min离心5 min，留取血浆，－20℃贮存。采用LC-MS/MS法测定血浆中苯海拉明的浓度，DAS 2.0软件分析其主要药动学参数，结果见表2；苯海拉明平均药-时曲线见图3。

表2 20名健康志愿者口服氨麻苯美片受试制剂与参比制剂后苯海拉明的主要药动学参数（±s ，n＝2 0）Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of diphenhydramine in 2 0 healthy volunteers after oral administration of test preparation and reference preparatio（n±s ，n＝2 0）

表2 20名健康志愿者口服氨麻苯美片受试制剂与参比制剂后苯海拉明的主要药动学参数（±s ，n＝2 0）Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of diphenhydramine in 2 0 healthy volunteers after oral administration of test preparation and reference preparatio（n±s ，n＝2 0）

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图3 20名健康志愿者口服氨麻苯美片受试制剂与参比制剂后苯海拉明的平均药-时曲线（n＝20）Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of diphenhydramine in 20healthy volunteers after oral administration of test preparation and reference preparation（n＝20）

3 讨论

已有文献报道采用液-质联用（LC-MS）法、高效液相色谱（HPLC）法、气相色谱（GC）法[1-4]等测定血浆中苯海拉明的浓度。但LC-MS法灵敏度欠佳，HPLC法往往专属性不强、耗时较长，而GC法在样品处理上又比较繁琐。上述方法对单独组分的确定尚存在问题，因此很难满足同时测定多种待测物的需要。本研究建立的LC-MS/MS法，血浆样品用量少，操作步骤简便易行，且测试速度快，样品检测时间仅3 min。试验结果证实，该法灵敏、准确、专属性强、重现性好，经方法学的全面考察确证其符合生物样品测定的要求，适用于苯海拉明血浆浓度测定及其药动学和生物利用度研究。2种制剂生物等效。

[1]朱运贵，王峰，肖轶雯.盐酸苯海拉明片在中国健康人体内的药动学研究[J].中国药房，2006，17（14）：1084.

[2]邹梅，程刚，安峰.扑苯黄片相对生物利用度的研究[J].中国药学杂志，2002，37（1）：36.

[3]Chao ST，Prather D，Pinson D，et al.Effect of food onbiovailability of pseudoephedrine and brompheniramine administered from gastrointestinal therapeutic system[J].Pharm Sci，1991，80（5）：432.

[4]韩莹，陈笑艳，谢智勇，等.液相色谱-串联质谱法同时测定人血浆中伪麻黄碱和苯海拉明[J].药学学报，2003，38（1）：67.