猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

姜 雪,高玉伟,胡桂学,杨松涛,赵艳丽,刘秋燕,徐春忠,梁秀娟,夏咸柱

(1.吉林农业大学 动物科学技术学院,长春 130118;2.解放军军事医学科学院 军事兽医研究所,长春 130062;3.上海野生动物园,上海 201300；4.吉林省野生动物救护繁育中心,长春 130122)

猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)为单股正链RNA,无囊膜,直径30～40 nm[1],是一种猫和部分猫科动物普遍存在的病原体.易感动物感染FCV后表现为口腔溃疡、上呼吸道感染、慢性口炎、鼻炎、结膜炎、肺炎或跛行等临床症状[2-3]，其临床症状的多样性取决于FCV基因的多样性[4],与由猫疱疹病毒(FHV)引起的猫传染性鼻炎相似,二者也常混合感染[5].高致病性FCV可引起动物全身性感染,甚至死亡.感染FCV的猫一部分恢复健康,另一部分成为无症状的病原携带者[6].检测FCV的方法有病毒分离鉴定和血清学实验,对分离的病毒可通过电镜检查、RT-PCR、荧光定量PCR鉴定或与已知抗血清做中和、琼扩、免疫荧光或补结实验进行鉴定[1].其中荧光定量PCR方法应用广泛[7-12],如Sykes等[13-14]建立了对FCV检测的普通PCR方法;Helps等[15]用染料法建立了FCV荧光定量PCR检测方法;Wilhelm等[16]以FCV的ORF2为目的基因建立了荧光定量PCR方法检测FCV,最低检测范围为(5×101～5×102)拷贝/μL.本文通过优化FCV荧光定量PCR条件,为临床样品的检测提供准确而快速的检测方法.

1 材料与方法

1.1 毒株和细胞

FCV由军事兽医研究所于2012年分离自国内某患病死亡的虎；猫鼻气管炎病毒(FRtV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)和猫肾细胞(F81)均为吉林农业大学动物科学技术学院实验室保存.

1.2 主要仪器和试剂

德国Tiangen公司生产的Agilent Mx3000P型实……