棘胸蛙嗜水气单胞菌的生物被膜特性

马有智

(浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310030)

嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophica，Ah)是有鞭毛无荚膜的革兰氏阴性短杆菌，可引起蛙类的红腿病等［1］。由于抗生素的滥用，导致嗜水气单胞菌的耐药性增强，多重耐药性菌株不断增加［2-4］，给水产动物嗜水气单胞菌病的防治造成困难，同时严重影响水产品的质量安全。生物被膜(Biofilm，BF)是指附着在任何物体表面或两相交界面的具有一定结构的微生物群体，其外包裹了一层由其自身分泌的胞外多糖类基质［5］。与游离菌相比，形成生物被膜的细菌具有很多不同的性能，其特征是对抗菌剂的抗性增强。试验对分离自发病的棘胸蛙细菌生物被膜进行测定和形态观察，为监控嗜水气单胞菌的耐药性和有效防治嗜水气单胞菌病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

嗜水气单胞菌AH02，AH03，AH06和AH07，分离自发病的棘胸蛙。小白鼠，体重15～20 g，购自浙江大学实验动物中心，试验前饲养3 d，证实健康后应用。健康棘胸蛙来自杭州某棘胸蛙养殖场，规格为25～35 g，室内暂养7 d无异常后应用。

1.2 生物被膜检测

体外生物被膜形成及测定方法参照文献 ［6］的微孔板法并进行适当改进。具体步骤:将细菌过夜培养液与新鲜BHI培养液按1∶3体积混匀后，取200μL加入到96孔酶标板小孔中，28℃湿盒静置培养24 h，弃去培养液，用0.85%的无菌生理盐水250μL洗涤2次以去除游离细菌，干燥后往各孔加入200μL 0.1%结晶紫染色液，染色30 min后弃去染色液，0.85%的无菌生理盐水250μL洗涤3次，加入33%的乙酸溶液200μL，30 min后完全溶解，用酶标仪测其D570值。各试验孔均设8个平行孔，以不含菌液的培养液为空白对照。

1.3 生物被膜扫描电镜观察

将细菌过夜培养液按1∶20稀释，转接到24孔细胞培养板上，各孔中垂直放置大小合适的无菌盖玻片，28℃培养24 h。培养结束后，取出盖玻片，按照电镜扫描的要求进行制片观察。

1.4 动物试验

小白鼠毒力试验。取分离株18 h BHI培养物，分别腹腔注射6只小白鼠。每只小鼠注射剂量为0.2 mL，观察发病和致死情况。

动物回归试验。分离株接种于BHI液体培养基，28℃恒温培养18 h后，细菌浓度调整为2.27×107mL-1备用。健康棘胸蛙随机分成2组，实验组取10只，按每只0.2 mL剂量腹腔注射菌悬液;对照组10只腹腔注射相同剂量无菌肉汤。连续观察记录7 d，对发病棘胸蛙无菌操作取其肝、脾等进行病原菌的分离纯化。1.5 药物敏感性试验

药物敏感性采用纸片 (药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司)琼脂扩散法进行。调节菌悬液细菌浓度为1.7×107mL-1，操作方法及结果判定参照文献 ［7］。

2 结果与分析

2.1 菌株生物被膜D值

图1表明，4株细菌在BHI培养基28℃培养24 h后，形成生物被膜的能力不同，AH07最高，AH02和AH03次之，AH06最低。差异分析显示，AH07，AH03与AH06之间有极显著差异 (p＜0.01)，AH02与AH06之间有显著差异 (p＜0.05)。

图1 嗜水气单胞菌分离菌株培养24 h的生物被膜测定结果

2.2 菌株生物被膜电镜扫描

从电镜扫描结果 (图2)看，4株菌形成的生物被膜的紧密程度不同，AH07细菌之间紧密度最高;AH06紧密度最低，细菌之间不能紧密相连，形成较大的裂隙;AH02和AH03细菌间紧密度较AH07要低一些。

图2 嗜水气单胞菌分离菌株形成的生物被膜的电镜扫描结果 (×10 000)

2.3 菌株对小白鼠的致病性

4株细菌对小白鼠均表现出一定的致病性，其中接种AH02，AH03和AH07等3株细菌的小白鼠均在24 h内死亡，AH06菌株引起3只小白鼠死亡，死亡率为50%，对照组无异常，显示4株嗜水气单胞菌分离菌株都具有一定的致病力，AH06菌株致病力较弱。

试验组棘胸蛙腹腔注射菌悬液后，在7 d内注射AH02和AH07菌株的全部死亡，注射AH03的死亡9只，注射AH06组死亡6只，发病棘胸蛙表现出与自然发病棘胸蛙相似的症状，对照组无异常表现。

4株细菌均对氧氟沙星敏感;AH02，AH03和AH06对四环素、氯霉素、庆大霉素等药物敏感;AH07对氨苄青霉素、大观霉素、阿米卡星、四环素、红霉素、阿奇霉素、克林霉素耐药。

3 小结与讨论

细菌生物被膜是细菌耐药性形成的重要机制之一，也是许多慢性感染性疾病反复发作和难以控制的主要原因，生物被膜的形成与细菌的致病性也具有一定的相关性［8-9］。分离自发病的棘胸蛙嗜水气单胞菌菌株之间毒力存在差异，AH02，AH03和AH07等3株细菌对小鼠和棘胸蛙均具有较强的毒力，而AH06菌株的毒力较弱，菌株之间的差异也表现在理化特性上，AH06菌株V-P试验为阳性，在绵羊血平板上不产生溶血现象，而溶血素与细菌毒力相关［10］。药敏试验表明4株分离菌对抗生素的敏感性不同，其中3株菌对左氧氟沙星、氯霉素、庆大霉素等均敏感，而AH07菌株对氨苄青霉素等多种抗生素耐药，且AH07菌株形成生物被膜的能力也最强，说明生物被膜的形成与细菌的耐药性有一定的关系，这一结果为临床防治中抗生素的选择提供依据。4株分离菌的毒力和生物被膜形成能力具有一定的差异，AH02，AH03和AH07等3株细菌对试验动物的致病性较强，其生物被膜的形成能力也较强，电镜扫描图也显示紧密度要高一些，而AH06菌株的致病性与生物被膜的形成量均较其他3株菌低，说明致病性与生物被膜的形成有一定的关系，至于两者之间关系的机制还需要进一步的研究。

［1］ 陆承平.致病性嗜水气单胞菌及其所致鱼病综述［J］.水产学报，1992(16):282-288.

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