薄荷不同溶剂提取物抗氧化活性的研究

陈智坤，梁呈元，李维林，任冰如，马 丽

(江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京210014)

薄荷(Mentha canadensisL.)为唇形科薄荷属植物，主要分布在中国、日本、韩国、俄罗斯及北美等地区［1］，作为重要的药食两用植物，其被广泛应用于医药、食品、化妆品、香料、烟草等工业。我国约有两千年的薄荷药食历史，具有散风热清头目、利咽喉、透疹、解郁等功效，主治风热表证，头痛目赤，咽喉肿痛，麻疹不透，隐疹瘙痒，肝郁胁痛［2］。研究表明薄荷属植物主要含有挥发油、黄酮、多酚、萜类、氨基酸等成分，具有抗氧化、抗菌、抗癌、抗糖尿病等作用［3］。现代研究表明，抗氧化剂具有延缓人体衰老，降低多种疾病产生，增强人体免疫能力等多种功能。因此，研究开发广谱、高效、安全的天然抗氧化剂已成为当今研究的热点之一［4-7］。目前，薄荷属植物抗氧化活性研究已有相关报道，研究结果显示该属植物表现出良好的抗氧化能力［8-11］。本文采用 DPPH、ABTS、FRAP三种模型对薄荷的水、甲醇、70%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯五种提取物进行抗氧化体外活性研究，并测定其总酚和总黄酮含量，进行相关性分析，为进一步研究薄荷的抗氧活性及资源开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

薄荷 采自南京中山植物园薄荷资源苗圃，经梁呈元研究员鉴定为薄荷(M.canadensisL.)，在恒温鼓风干燥箱内105℃杀青15min，60℃干燥3h，粉碎过60目筛备用;DPPH、ABTS Sigma公司;FRAP试剂盒 碧云天生物技术研究所;没食子酸标准品国药集团化学试剂有限公司;芦丁对照品 中国药品生物制品检定所，批号:100080-200306;其他试剂均为分析纯。

Infinite M200型酶标仪 TECAN公司;R-Ⅱ型旋转蒸发仪 BUCHI公司;EL204型电子天平Mettler Toledo公司;KQ-300DE型超声仪 昆山超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取方法 薄荷干药材25g，料液比1∶20，超声功率100W，50℃、30min下分别用水、甲醇、70%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯超声提取两次，趁热抽滤并浓缩得到黑色浸膏，置60℃恒温烘箱干燥24h至重量不发生改变，得到黑色固体质量分别为4.2、3.8、3.4、0.7、0.8g。

1.2.2 抗氧化活性的测定

1.2.2.1 清除DPPH自由基实验 取不同提取物，DMSO溶解，配制成10mg/L母液。DPPH用无水乙醇配制成0.16mmol/L，置于棕色瓶中备用。在96孔板中，每孔分别入20μL不同浓度的样品溶液，80μL超纯水和 100μL的 0.16mmol/L DPPH，反应体系200μL。加样后室温避光振荡15min，将96孔板放入酶标仪中在517nm波长处检测样品的吸光度(Ai);取20mL DMSO代替样品溶液测得空白吸光度(A0);以100μL无水乙醇代替DPPH溶液测得样品本底吸光度(Aj);每个浓度做4个平行，取其平均值。以VC做阳性对照，按式(1)计算清除率，并计算出EC50值［12］。

1.2.2.2 清除ABTS自由基实验 ABTS混合液的制备:将7mmol/L ABTS水溶液与2.45mmol/L过硫酸钾水溶液(终浓度)混合，将混合液在室温避光条件下放置12～16h，形成ABTS储备液。将此工作液与乙醇按照约1∶20(v/v)的比例混合在734nm下调吸光度为0.700±0.02即得，于30℃下预热备用。在96孔板中，每孔分别入10μL不同浓度的样品溶液，190μL ABTS 混合液，反应体系200μL。反应10s，静置10min，将96孔板放入酶标仪中在734nm波长处检测样品的吸光度(Ai);取10μL DMSO代替样品溶液测得空白吸光度(A0);以190μL无水乙醇代替ABTS混合液测得样品本底吸光度(Aj);每个浓度做4个平行，取其平均值。以VC做阳性对照，按式(1)计算清除率，并计算出 EC50值［13］。

1.2.2.3 FRAP法抗氧化实验 按说明书，称取27.8mg FeSO4·7H2O，用去离子水溶解、定容至1mL，即浓度为100mmol/L。取适量 FeSO4溶液稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mmol/L。在 96 孔板中，每孔分别入180μL现配的FRAP工作液，加入5μL去离子水做空白对照，5μL各种浓度的FeSO4标准溶液，反应体系为 185μL，在 37℃下反应 3～5min，在593nm下测定吸光度，每个检测做4个重复，取其平均值，以Trolox为阳性对照。最后根据FRAP标准曲线求得各样品的抗氧化能力。

1.2.3 含量测定

1.2.3.1 总黄酮含量测定 准确称取120℃干燥至恒重的芦丁标准品20mg，置于100mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容得到浓度为0.2mg/mL的芦丁标准溶液。准确移取 0、10、20、30、40、50、60μL 芦丁标准溶液于96孔平板中，每孔先分别用60%乙醇补齐至104μL，再依次加入8μL 5%NaNO2溶液，摇匀，静置6min;加入8μL 10%Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6min;再加入80μL的1mol/L NaOH溶液，摇匀，静置15min;将96孔平板放入酶标仪中在510nm波长处测吸光值，每个检测做4个重复，取其平均值。最后根据芦丁标准曲线求得各样品的总黄酮含量。

1.2.3.2 总酚含量的测定 精密称取15mg没食子酸置于10mL容量瓶中，用蒸馏水溶解后定容至刻度，摇匀，配制成1.5mg/mL的标准品溶液，转移至棕色瓶中以备用;配制100mg/mL Na2CO3溶液。在96孔板中依次加入没食子酸标准品溶液 0、1、2、4、6、8μL，用蒸馏水将每个加样孔补至50μL，然后分别加入50μL Folin-Ciocalteu试剂，振荡3min后加入50μL 100mg/mL Na2CO3溶液充分混匀，在室温下放置5h后，将96孔板放入酶标仪中在760nm波长处测定各样品的吸光值，每个检测做4个重复，取其平均值。最后根据没食子酸标准曲线求得各样品的总酚含量。

1.3 数据处理

实验采用SPSS17.0软件进行统计分析，进行单因素方差分析(ANOVA法)和双变量相关性分析，同时进行LSD两两比较，以p＜0.05为差异显著，所有数据均以平均数±标准差(¯±s)表示。

2 结果与分析

2.1 对DPPH自由基的清除作用

由图1和表1可见，薄荷五种不同提取物均对DPPH自由基表现良好的清除能力，在0.3125～5mg/mL范围内，抗氧化活性随浓度升高而升高，在水提物浓度为5mg/mL时抑制率达到最大为88.68%，DPPH自由基清除能力大小顺序为:水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞甲醇＞70%乙醇。

图1 薄荷不同提取物对DPPH自由基清除率(%)Fig.1 Percentage of free radical scavenging activity of different extracts from Mentha canadensis L.by DPPH radicals in vitro assay

2.2 对ABTS自由基的清除作用

由图2、表2可见，薄荷五种不同提取部位对ABTS自由基均具有一定的清除能力，但相对清除DPPH自由基能力较弱，且清除率随浓度的升高和升高，其中甲醇在10mg/m L时对ABTS自由基清除率达到95.44%，提取物对ABTS自由基的清除顺序为:甲醇＞水＞乙酸乙酯＞正丁醇＞70%乙醇。

表1 薄荷不同提取物对DPPH自由基清除的EC50值(p＜0.05)Table 1 The EC50 of different extracts from Mentha canadensis L.by DPPH radicals in vitro assay(p＜0.05)

表2 薄荷不同提取物对ABTS自由基的清除的EC50值(p＜0.05)Table 2 The EC50 of different extracts from Mentha canadensis L.by DPPH radicals in vitro assay(p＜0.05)

表3 薄荷不同提取部位FARP值(p＜0.01)Table 3 The FARP value of different extracts from Mentha canadensis L.by FARP in vitro assay(p＜0.01)

表4 薄荷不同提取物中多酚含量(p＜0.05)Table 4 Total phenolic content in different extracts from Mentha canadensis L.(p＜0.05)

表5 薄荷不同提取部位中总黄酮含量(p＜0.01)Table 5 Total flavonoids content in different extracts from Mentha canadensis L.(p＜0.01)

图2 薄荷不同提取物对ABTS自由基清除率Fig.2 Percentage of free radical scavenging activity of different extracts from Mentha canadensis L.by ABTS radicals in vitro assay

2.3 FRAP法测定抗氧化能力

样品的抗氧化活性由FARP标准曲线为:Y=0.0286X+0.0686(R2=0.9907)换算得来，各提取部位的抗氧化活性如表3所示。

由表3可见，通过FARP法测定薄荷五种不同提取部位总抗氧化能力顺序为:乙酸乙酯＞正丁醇＞水＞甲醇＞70%乙醇。

2.4 总酚的含量测定

样品中的多酚含量由没食子酸标准曲线:Y=46.9X-0.0283(R2=0.9922)换算得来，各提取部位的多酚含量如表4所示。

由表4可见，五种提取方法中，总酚含量顺序为，水＞乙酸乙酯＞正丁醇＞甲醇＞70%乙醇，其中水提取物中多酚含量最高，这与大多数多酚属大极性化合物，易溶于大极性溶剂有关。

2.5 总黄酮的含量测定

样品中的总黄酮含量由没食子酸标准曲线:Y=5.834X+0.0416(R2=0.9992)换算得来，各提取部位的总黄酮含量如表5所示。

由表5可见，甲醇提取物中黄酮类化合物含量最高，乙酸乙酯提取物中黄酮含量较多，水提取物中黄酮含量较少，这与薄荷中可能含有中等极性黄酮类成分较多有关。

2.6 抗氧化活性间相关性分析

在数据处理时，因在一定范围内，EC50越小代表抗氧化能力越强，因此对于计算有关EC50相关性存在负号(-)现象，应作正相关处理。由表6可见薄荷提取物对DPPH、ABTS、FRAP抗氧化活性基本一致，但略有差别，这可能与各抗氧化模型作用机理不同有关。

表6 薄荷抗氧化活性间相关系数(r)Table 6 Correlation coefficient(r)of treemodels of antioxidant activity

2.7 多酚、黄酮含量与抗氧化活性相关性分析

现代研究表明抗氧化活性与植物体中多酚和黄酮含量有密切的关系［14］，因此对不同提取部位的多酚和黄酮含量进行测定，并进行相关性分析，通过统计学分析寻找薄荷产生抗氧化活性的主要原因。

由表7可见，薄荷各提取物对DPPH自由基、ABTS自由基、FARP的抗氧化活性与多酚含量均显示出极显著正相关性，即在一定范围内多酚含量越高，对三种抗氧化模型的活性越强;而提取物对DPPH和ABTS的抗氧化活性与黄酮含量显示相关性不高，FARP的抗氧化活性与黄酮含量则显示显著正相关。

表7 薄荷抗氧化活性与其多酚、总黄酮含量的相关系数(r)Table 7 The relationship between the antioxidant activity and the content of total phenolics and total flavonoids

3 结论

薄荷表现出对 DPPH自由基、ABTS自由基、FRAP良好的抗氧化能力，且相关性基本一致，其活性部位主要集中在大极性化合物上。其中水和甲醇提取部位抗氧化能力相对较高，正丁醇和乙酸乙酯次之，70%乙醇相对较弱。经抗氧化活性与多酚和黄酮含量相关性数据分析显示，薄荷抗氧化活性与多酚含量有密切关系，与黄酮含量相关性较小，这一结果与 Tupe［9，15-18］等研究薄荷属植物抗氧化结果基本一致。薄荷属植物作为重要的芳香植物，目前，研究其挥发性成分相对较多，本实验对薄荷的非挥发性提取部位的抗氧化活性研究，将为进一步研究其活性成分奠定基石，为寻找其抗氧化活性机理提供依据，为未来薄荷属植物的资源开发提供依据。

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