果汁饮料中邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的测定及其来源分析

杨春英，刘学铭，徐玉娟

(广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东省农产品加工公共实验室，广东 广州 510610)

2011年4月，台湾爆发了堪称30年来最严重的食品掺毒事件——增塑剂邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(bis(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP)风波，这是继“三聚氰胺”后又一次重大食品安全危机，已经引起全球公众的极大关注。增塑剂，又称为邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)，是一种有毒的化工用塑料软化剂[1-3]，其对人体的危害性远远大于三聚氰胺[4-6]，PAEs通过呼吸、饮食和皮肤接触进入人体[7-8]，长期接触邻苯二甲酸酯对外周神经系统有损伤作用，可引起多发性神经炎和感觉迟钝、麻木等症状，对中枢神经系统也有抑制和麻醉作用。常用的PAEs主要有邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丙烯酯(DAP)、DEHP、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)等[9-10]。其中，DEHP是一种使用最广泛的塑化剂[11]，在塑胶材料中普遍使用[12]。DEHP的作用类似于人工荷尔蒙[13]，会危害男性生殖能力并促使女性性早熟，长期摄入可引起生殖系统异常，甚至有造成畸胎、癌症的危险。含有DEHP的“起云剂”已被非法应用于部分饮料等产品的生产加工[14]，必须重视对饮料等食品中的DEHP检测。

本研究建立D E H P 的气相色谱-质谱联用(g a s chromatography-mass spectrometry，GC-MS)检测方法，并利用该方法对市售不同包装规格果汁饮料(橙汁、葡萄汁、芒果汁、混合果汁)中DEHP的含量进行测定，同时对其进行溯源分析，以期为果汁饮料的安全性评价提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橙汁、葡萄汁、芒果汁和混合果汁饮料(玻璃瓶装、500mL纸盒装和1000mL纸盒装) 市售。

DEHP标准品(＞99.5%) 美国Sigma公司；正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、甲醇均为色谱纯试剂；所用的水为超纯水。

准确称取0.1000g DEHP标准品于100mL棕色容量瓶中，用正己烷定容，配制成标准储备液，于4℃冰箱中保存备用。再根据需要逐级稀释，配成标准系列溶液。

1.2 仪器与设备

6890N/5975B气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；CW-2000超声-微波协同萃取仪 上海新拓分析仪器科技有限公司；Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机 美国Themo公司；超声波发生器 宁波新芝生物科技股份有限公司；N-110S-W型旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社；万分之一分析天平 德国赛多利斯公司；实验所用的器皿均为玻璃器皿，清洗干净后用丙酮浸泡2h烘干待用。

1.3 方法

1.3.1 气相色谱条件

色谱柱：J&W D B-5 M S U I 毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)；进样口温度：250℃；进样量：1.0μL，不分流进样；载气：高纯氦气，流速为1.0mL/min；程序升温：初始温度60℃，保持1min，以20℃/min的升温速率升至220℃，保持1min，再以5℃/min的升温速率升至280℃，保持5min。

1.3.2 质谱条件

电子电离源(electron ionization，EI)，电子能量70eV；离子源温度230℃；传输线温度280℃；质量范围40～500u，全扫描方式；溶剂延迟4min。

1.3.3 样品处理

考察提取溶剂(包括纯溶剂和混合溶剂)、提取方式及提取时间对样品中DEHP提取率的影响，最终确定样品处理方法。

1.3.3.1 果汁试样

采用两种处理方法：①按照国标[15]：取5.00mL果汁试样，加入2.00mL正己烷振荡萃取40min，取上层清液进行气相色谱-质谱分析；②国标[15]基础上修改：取50.00mL果汁饮料试样，加入等体积正己烷振荡萃取40min，取上层清液25.00mL，用氮气浓缩至1.0mL，进行GC-MS分析。

1.3.3.2 纸质包装盒的塑料薄膜

取完整一张塑料薄膜(纸盒内侧与果汁接触部分)裁剪成0.5cm×0.5cm大小碎片[16]，准确称取2.0000g试样于具塞三角瓶中，每次加入15mL四氢呋喃-乙腈(1：1，V/V)的混合液，超声提取30min，过滤转移到50mL容量瓶，重复2次，合并滤液定容，待测。

1.3.3.3 纸质包装盒上的塑料盖

取5个完整塑料盖破碎成小于0.25cm×0.25cm颗粒[17]，混合均匀后准确称取1.0000g试样于微波萃取管中，加入15mL正己烷-乙酸乙酯(1：1，V/V)的混合液，在100℃条件下微波提取40min，过滤转移到50mL容量瓶，残渣用少量混合液洗涤3次，合并滤液定容；取上述提取液20.00mL，用氮气浓缩至1.0mL，进行GC-MS分析。

以上处理均设空白对照。

1.3.4 定性和定量方法

为保证测定结果的准确性，本实验使用保留时间、标准品对照和质谱检索三者结合的定性方法；外标法峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线和检测限

按照本研究优化的实验条件，配制7个质量浓度水平(1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、30.00、50.00mg/L)的标准溶液进行GC-MS分析，以峰面积Y对DEHP标样质量浓度X进行线性拟合，平行测定3次，得出线性拟合方程Y = 280986X－385822，DEHP质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，r=0.9978；检测限为0.4mg/L(RSN=3)。

2.2 提取溶剂的选择

参考国内外关于DEHP提取与测定的报道[14-18]，保持其他试验条件不变，比较正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈5种不同纯溶剂及混合溶剂：正己烷-乙酸乙酯(1：1，V/V)、四氢呋喃-乙腈(1：1，V/V)、乙酸乙酯-乙腈(1：1，V/V)对样品中DEHP的提取效果。以DEHP回收率为判断依据，发现对于果汁饮料样品，正己烷、二氯甲烷的萃取率最高(回收率＞90%)，但提取时乳化现象比较严重，加入少量甲醇或者冷冻离心分离可大大改善这种状况，考虑到二氯甲烷毒性较大，故选用正己烷作为果汁样品的萃取剂；对于包装材料，单种溶剂不如使用混合溶剂提取效果好，实验最终确定四氢呋喃-乙腈(1：1，V/V)的混合体系作为塑料薄膜的提取溶剂，正己烷-乙酸乙酯(1：1，V/V)的混合体系作为塑料盖的提取溶剂，回收率均可达到80%以上。

2.3 提取方式和时间的选择

由于果汁饮料属于液态食品，故选用液-液萃取。实验证明：DEHP提取率随振荡萃取时间的延长而增加，振荡萃取时间为40min时，回收率可达到最高值(92.5%)。

塑料薄膜为软质材料，使用超声波有利DEHP的溶出，考察不同时间(10、20、30min和40min)、不同提取次数(1、2次和3次)对DEHP的提取效果，研究表明提取时间为30min时提取效果较好，且提取2次后DEHP提取量增加趋势不明显，故选用超声波提取时间为30min，提取次数为2次。

塑料盖为硬质材料，微波和高温条件下可加速DEHP的提取，考察不同温度(90、95、100℃和105℃)、不同提取时间(20、30、40min和50min)对DEHP提取效果的影响，证实在100℃条件下微波萃取40min即可提取完全(回收率达95.8%)。

2.4 方法的精密度和准确度

为了检验方法的准确度和精密度，对选取的样品进行高(10.0mg/L)、中(5.0mg/L)、低(1.0mg/L)3个不同水平的加标回收实验，每个水平分别做7份平行实验，计算平均回收率和相对标准偏差，结果见表1。

表 1 加标回收率及重复性实验结果(n=7)Table 1 Recovery and reproducibility of the analytical method (n=7)

由表1可知，样品加标回收率平均值达到87%以上，相对标准偏差(RSD)在3.64%～6.95%之间，可见，选用的方法具有较强的可靠性，能满足分析需要。

2.5 实际样品的测定及其来源分析

用本研究建立的最优化方法，对市售不同厂家生产的不同包装规格橙汁饮料样品中的DEHP进行分析，为追溯其来源，同时对其包装材料进行DEHP的测定，结果见图1，表2、3。

图 1 果汁样品(a)及其加标样(b)总离子流色谱图Fig.1 TIC of juice sample spiked or not with DEHP standard

由图1可见，本实验建立的方法能够实现样品中的DEHP与基体中其他组分的良好基线分离，样品的回收率较高。

表 2 果汁样品中DEHP含量的测定结果(n=3)Table 2 DEHP content in juice samples (n=3)μg/L

表 3 包装材料中DEHP含量的测定结果(n=3)Table 3 DEHP content in plastic packaging materials for juice (n=3)mg/kg

由表2、3可知，由于果汁样品中DEHP的含量较低，必须经过浓缩；除橙汁外，其余3种玻璃瓶装果汁饮料中始终未检测到DEHP，表明该果汁在加工过程中未使用DEHP或含有DEHP的“起云剂”，且原料并未受到污染；橙汁饮料经浓缩后检测到微量DEHP，分析其原因可能是加工过程中人为添加或者受污染，也可能是原材料受污染，其来源可能是橙子产地的土壤、大气及灌溉水源。纸盒装果汁饮料中检测到微量的DEHP，塑料包装材料中均检测到一定量DEHP，以塑料薄膜含量居高。由于果汁饮料在储存过程中长期与塑料薄膜直接接触，且接触面积较大，而瓶装饮料存放过程中基本瓶盖朝上放置，塑料盖与果汁的接触面积较小，接触概率也相对小，故初步认为果汁饮料中的DEHP主要是储藏过程中从包装材料中迁移污染的，其中塑料薄膜为主要污染因素；纸盒装橙汁饮料中DEHP含量是玻璃瓶装的3倍以上，也证实了包装材料中DEHP迁移污染，导致橙汁饮料中DEHP含量大大增加。DEHP等PAEs在塑料成型过程中是以氢键和范德华力与塑料连接，保留其独立的化学性质，随着使用时间的推移，可不断地释放至周围环境[19]。释放的DEHP可溶解在果汁饮料中，造成污染，影响产品质量。但从包装材料中迁移的DEHP含量极低，由于含量过低，经浓缩后才检出，不会对人体造成危害。

3 结 论

本实验针对果汁饮料及其包装材料中的DEHP提取技术和测定方法进行了研究，确定了最佳的分析测定条件，方法操作简单、重现性好、准确度高，能较好实现对实际样品的测定。通过对包装材料中DEHP含量的测定，对果汁饮料的塑化剂来源进行分析，为食品安全性和溯源评价提供了一定的参考价值。值得注意的是，企业在生产过程中应该考虑周全、注意各个生产环节，避免与DEHP等有害物质的接触污染，保障消费者的身体健康。

[1] ZHANG Lifei, DONG Liang, REN Lijun, et al. Concentration and source identification of polycyclic aromatic hydrocarbons and phthalic acid esters in the surface water of the Yangtze River Delta, China[J]. Journal of Environmental Sciences, 2012, 24(2)： 335-342.

[2] SALIMA C J, LIUA H, KENNEDY J F. Comparative study of the adsorption on chitosan beads of phthalate esters and their degradation products [J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 81(3)： 640-644.

[3] LOHMANN R, GIOIA R, JONES K C, et al. Organochlorine pesticides and PAHs in the surface water and atmosphere of the North Atlantic and Arctic Ocean[J]. Environmental Science and Technology, 2009, 43(15)： 5633-5639.

[4] 徐磊, 夏宁. 在线固相萃取/高效液相色谱法测定环境水样中的4种痕量邻苯二甲酸酯[J]. 分析测试学报, 2011, 30(5)： 558-561.

[5] 陈如, 蒋晓琪, 王建平. 邻苯二甲酸酯及其生态毒性[J]. 印染助剂, 2010, 27(9)： 52-56.

[6] 赵文华, 王永凤, 赵冬梅. 邻苯二甲酸酯环境行为和毒理性研究[J]. 福建分析测试, 2010, 19(2)： 22-25.

[7] GUO Ying, WU Qian, KANNAN K. Phthalate metabolites in urine from China, and implications for human exposures[J]. Environment International, 2011, 37(5)： 893-898.

[8] HEMANDEZ-DIAZ S, MITCHELL A A, KELLEY K E, et al. Medications as a potential source of exposure to phthalates in the US population[J]. Environ Health Perspect, 2009, 117(2)： 185-189.

[9] 柴丽月, 辛志宏, 蔡晶, 等. 食品中邻苯二甲酸酯类增塑剂含量的测定[J]. 食品科学, 2008, 29(7)： 362-365.

[10] NANNI N, FISELIER K, GROB K, et al. Contamination of vegetable oils marketed in Italy by phthalic acid esters[J]. Food Control, 2011, 22(2)： 209-214.

[11] 刘芃岩, 高丽, 申杰, 等. 固相微萃取-气相色谱法测定白洋淀水样中的邻苯二甲酸酯类化合物[J]. 色谱, 2010, 28(5)： 517-520.

[12] LI Hongna, ZHU Xiuping, JIANG Yi, et al. Comparative electrochemical degradation of phthalic acid esters using boron-doped diamond and Pt anodes[J]. Chemosphere, 2010, 80(8)： 845-851.

[13] FOSTER P M. Disruption of reproductive development in male rat offspring following in utero exposure to phthalate esters[J]. Int J Andro, 2006, 29(1)： 140-147.

[14] RANDY L S, WU W H. Rapid qualitative analysis of phthalates added to food and nutraceutical products by direct analysis in real timeorbitrap mass spectrometry[J]. Food Control, 2012, 25(1)： 13-16.

[15] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB/T 21911—2008 食品中邻苯二甲酸酯的测定[S]. 北京： 中国标准出版社, 2008.

[16] 楼佳. 快速溶剂萃取-气相色谱/质谱联用测定塑料桌布中的邻苯二甲酸酯[J]. 化学研究, 2011, 22(2)： 65-67.

[17] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. SN/T 2249—2009 塑料及其制品中邻苯二甲酸酯类增塑剂的测定： 气相色谱-质谱法[S]. 北京： 中国标准出版社, 2009.

[18] 孙若男, 陈美瑜, 林竹光. 气相色谱-质谱联用同时测定蔬菜中16种邻苯二甲酸酯残留[J]. 分析试验室, 2010, 29(12)： 73-76.

[19] 姚卫蓉, 俞晔, 阎微, 等. 食用油中邻苯二甲酸酯污染物的测定方法及其污染程度研究[J]. 中国油脂, 2010, 35(6)： 38-41.