奥沙利铂联合单次大剂量照射对大鼠胰腺的放射损伤

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(1 青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003； 2 章丘市人民医院肿瘤放疗科)

胰腺癌是消化系统中较常见的恶性肿瘤之一，多数病人就诊时即处于中晚期，病死率高达90%，被认为是可治疗但不可治愈的疾病。放化联合治疗为其主要治疗手段。但胰腺癌对放化疗并不太敏感，常规放疗模式靶区内包括的正常组织多，限制了分次剂量及总剂量的提高，生物效应剂量较低，局控率差，副作用大。立体定向放射治疗(SRT)可提高单次放疗剂量[1]，在短期内完成治疗，不会产生因时间延长而导致的剂量耗损，有利于等效生物学剂量(BED)的提高，从而提高疗效，但部分正常胰腺也会受到照射。目前有关同步放化疗后正常胰腺损伤的基础研究甚少。本研究旨在通过动物实验观察奥沙利铂化疗联合单次大剂量照射后，胰腺组织发生的组织学及相应指标的改变，为放化疗过程中胰腺等正常组织保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Wistar 大鼠80只，清洁级，均为雄性，体质量为200～250 g，由青岛市药检所提供。试剂：Bcl-2鼠抗人单克隆抗体、Bax兔抗人多克隆抗体及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒等,均购自Santa Cruz Biotechnology Inc公司；40 g/L甲醛溶液由青岛大学医学院附属医院病理科提供。所用仪器如下：旋涡混合器XW-80A；自制大鼠固定板；低温高速离心机Contifuge Stratos；美国瓦里安23EX直线加速器；芬兰Labsystems加样器、Epics XL·MCL流式细胞仪等。

1.2 动物分组及处理

将大鼠随机分为化疗组(A组)、放疗组(B组)、同步放化组(C组)和对照组(D组)，各20只。A组给予腹腔注射奥沙利铂15 mg/kg，B组给予6 MV X线12 Gy一次性照射大鼠腹部，C组腹腔注射奥沙利铂15 mg/kg后随即行6 MV X线12 Gy腹部照射。分别于照射后第3、7、14、21、42天，在深度麻醉下处死大鼠，每次4只。D组仅给予腹腔注射等量生理盐水及假照，在相应时间内每次处死4只。大鼠处死后取胰腺组织，石蜡包埋。

1.3 胰腺组织形态学观察

胰腺组织用40 g/L的甲醛固定后经取材、脱水、包埋、固定、切片等，行苏木精-伊红(HE)染色，观察胰腺的组织学变化。

1.4 Bcl-2、Bax蛋白表达检测

采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(S-P法)[2]。Bcl-2、Bax阳性细胞胞膜、胞浆中出现棕黄色颗粒。400倍显微镜下，每张切片随机选取10个视野，每个视野计数200个细胞，共计2 000个细胞，计算细胞阳性表达率。细胞阳性表达率=阳性细胞数/计数细胞总数×100%。

1.5 统计学处理

应用SPSS 18.0软件对数据进行分析，数据间比较采用析因设计方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组胰腺组织形态学比较

肉眼观察，D组胰腺灰粉色，可见正常的胰腺小叶结构，与周围脂肪组织分界不清，腹腔液清；A组胰腺肉粉色，质软，肿胀，部分小叶结构消失，腺体血管充血，腹腔液浑浊，与周围组织稍有粘连；B组胰腺黄白色，质硬，肿胀，与周围组织有粘连，腹腔液浑浊；C组胰腺粉白色，质脆，胰腺小叶分界不清，腺体血管明显充血，与周围组织明显粘连，血性腹腔液。

光镜下观察，照射后第3天，A组少量腺细胞水肿紊乱，腺叶间少量淋巴细胞浸润；B组胰腺空泡变性，伴有胞浆水肿；C组大鼠胰腺出现较多空泡变性，胞浆水肿，胰腺实质内可见点片状出血。第7天，A组胰腺腺体内有较多炎症细胞，血管充血，局部坏死；B组大片空泡变性，出现腺细胞萎缩,间质出现纤维化；C组腺体炎症浸润伴纤维组织增生，空泡变性广泛，腺细胞萎缩，内部分泌物减少，周围间质内脂肪细胞变性。第14天， C组腺体仍有炎症细胞浸润，腺叶组织变性，血管内充血，空泡变性坏死，腺细胞减少并间质纤维增生；A组及B组变化同C组，但较C组改变轻。第21天， A组周围间质内炎性细胞几乎消失； B组腺叶间隙变大,空泡变性基本消失，间质纤维增生明显；C组周围间质内有少量炎症细胞，腺叶细胞变性，周围间质组织明显纤维增生。第42天， A组胰管上皮细胞高柱状排列清晰； B组腺细胞增殖活跃，可见腺泡上皮细胞异型，腺管内充满分泌液；C组腺管内分泌液较多，腺细胞增殖，胰腺小叶间、胰岛细胞间及小叶内胰管周围纤维化明显。

2.2 各组不同时间Bcl-2蛋白表达比较

在胰岛细胞中，各时间点A、B、C组Bcl-2阳性表达率均较对照组明显升高，差异有显著性(F=101.9～3 108.6,P<0.01)；各实验组在第7天表达率最低(F=1 014.3～3 584.4,q=17.4～146.5，P<0.01)，其中C组Bcl-2表达率最低，差异有显著意义(q=3.0～18.3，P<0.01)。在腺泡细胞中,各时间点实验组Bcl-2阳性表达率均较对照组升高，差异有显著性(F=39.9～135.1，P<0.01)；各实验组第7天表达率最低(F=812.1～1 049.7,P<0.01)，C组低于A、B、D组，差异有显著意义(q=4.3～16.5，P<0.01)。随着时间的延长，各组Bcl-2表达呈上升趋势，第42天时，C组两种细胞的Bcl-2阳性表达率与A、B组相比较，差异无显著意义(P>0.05)。见表1、2。

2.3 各组不同时间Bax蛋白表达比较

在胰岛细胞中，各实验组Bax阳性表达率在第3、7天均较对照组升高，差异有统计学意义(F=178.5、195.9，P<0.01)；其中C组第7天表达率最高，与A、B、D组比较差异有显著意义(q=6.7～12.0,P<0.01),自第14天起表达率逐渐低于对照组。在腺泡细胞中，各实验组不同时间Bax蛋白阳性表达率均较对照组升高，第3、7、14天差异有显著意义(F=4.6～24.4，P<0.01)；各实验组Bax蛋白阳性表达率在第3天最高(F=96.9～138.3，P<0.01),其中以C组表达率最高，与其他组相比差异有统计学意义(q=21.4～32.1，P<0.01)。随着时间的延长，各组表达逐渐趋于阴性。见表3、4。

表1 各组胰岛细胞Bcl-2蛋白阳性表达率比较

表2 各组腺泡细胞Bcl-2蛋白阳性表达率比较

表3 各组胰岛细胞Bax蛋白阳性表达率比较

表4 各组腺泡细胞Bax蛋白阳性表达率比较

3 讨 论

在我国，胰腺癌死亡率占所有恶性肿瘤的第5位，5年生存率<5%[2]。大约40%的病人就诊时即为局部晚期，放化联合治疗已成为晚期胰腺癌的主要治疗手段。近来有研究显示，吉西他滨、奥沙利铂和干扰素等在胰腺癌治疗过程中均是可选择的放疗增敏剂。目前大剂量精确放疗已成为提高疗效的一个重要发展方向，立体定向体部放射治疗(SBRT)等大分割治疗模式的应用，可实现大剂量照射癌组织，缩短疗程，从生物有效率的角度来说是比较合适的选择[3]。但由于呼吸运动、靶区勾画、摆位误差等原因，不可避免地会照射到部分正常胰腺，引起胰腺的放射性损伤，导致消化功能降低，增加糖尿病的发生风险。单次大剂量放疗联合化疗对胰腺损伤的研究比较少。本实验通过观察奥沙利铂化疗联合单次大剂量照射大鼠腹部后胰腺组织的损伤情况，为大分割模式等临床新技术的应用提供一定的定性资料，为保护胰腺提供相应的动物实验数据。

放射治疗原则是给予一定肿瘤体积准确的、均匀的剂量；尽量提高治疗区域的剂量，降低照射区正常组织受量范围；根据Fowler公式，单次剂量越大，生物效应越大[5]。近年来，立体定向适形技术的进展为低分割大剂量照射提供了条件。但低分割放疗也增加正常组织特别是晚反应组织的损伤。吕红英[6]报道，胰腺组织受到2、4、6、8 Gy的X线一次性照射后第7天,电镜观察可见线粒体肿胀，电子密度下降，内有空泡，外分泌部内质网较整齐、发达，内见酶原颗粒，而内分泌部染色淡，内质网欠发达；照射后第14～21天时胰腺内空泡少见，线粒体较完整，可见嵴；照射后第42天时核形态改变，异染色质增多、断裂。本文光镜观察结果与其吻合。说明胰腺的形态及病理学改变与其受照剂量大小有关。

化疗和放疗治疗肿瘤的主要机制之一就是诱导肿瘤细胞凋亡。奥沙利铂是继顺铂、卡铂之后的具有细胞毒作用的第三代铂类抗癌药，以DNA为作用部位，铂原子与DNA链形成链内和链间交联，阻断DNA的复制和转录[4]。体内外临床前研究表明，奥沙利铂对多种肿瘤细胞都有抗癌作用，尤其对消化系统肿瘤具有显著疗效。放射损伤的靶标是DNA，细胞受放射损伤后反应包括细胞周期阻滞、DNA修复机制激活和死亡。射线导致细胞死亡的一个主要途径是激活细胞凋亡机制[8]。细胞凋亡即程序性死亡,是基因调控的主动而有序的自我消亡的过程，是指连续性的不伴有炎症反应的细胞变化，最终导致细胞死亡[7]。目前已有研究表明，细胞内Bax与Bcl-2的比值是决定化疗敏感性的重要因素。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因，并且Bax是Bcl-2活性的主要调控因子[9]。Bcl-2与Bax结合，形成Bcl-2/Bax异源二聚体，两者的比值决定了细胞接受调控信号后细胞的存活与否。当Bcl-2表达水平高于Bax时，自身形成同源二聚体，细胞凋亡受到抑制；Bax表达水平高于Bcl-2时形成同源二聚体，细胞凋亡增强。正常胰腺细胞中Bax蛋白表达较少或不表达，Bcl-2表达较强；细胞发生凋亡时，Bax蛋白表达增多，Bcl-2表达常较弱。孙宝刚[10]研究显示，放疗前加入化疗药物可提高细胞凋亡率，其机制可能与降低Bcl-2表达及提高Bax表达有关。本文研究中，根据实验动物与人的药物剂量换算方法，预实验得出每只大鼠所用奥沙利铂为15 mg/kg。研究结果显示，放化疗组的正常胰腺组织在照射后的一段时间内损伤程度较单纯放疗组及单纯化疗组严重，可能与放化疗引起DNA损伤较重，诱导细胞凋亡，胰岛细胞与腺泡细胞Bcl-2表达率降低，Bax表达率升高，抗凋亡蛋白减少，凋亡蛋白增加有关；随着时间的推移，同步放化组腺泡细胞Bcl-2蛋白表达阳性率升高，Bax表达由阳性变为阴性；胰岛细胞Bcl-2表达阳性率逐步升高，Bax表达阳性率下降，与单纯放疗组及单纯化疗组恢复一致。其机制可能是正常组织损伤后的代偿性改变，抗凋亡蛋白Bcl-2表达增高，凋亡蛋白Bax表达降低，从而降低凋亡的发生。本文结果与大多数研究结果相符。

综上所述，奥沙利铂化疗联合同期大剂量放疗时正常胰腺的损伤较单纯放疗组及单纯化疗组严重，其机制可能与化疗后放疗加重DNA的损伤,激活细胞凋亡，引起细胞凋亡蛋白的增加，从而加重了细胞的损伤有关。提示临床上同期放疗化疗结合时需适当调整化疗剂量及寻求放疗的最佳范围，以最大限度地减少胰腺的损伤。

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