低氢氰酸含量高丹草新品系及其亲本的SSR分析

于卓，谢锐，于肖夏，马艳红，李造哲，纪明妹

(内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特010019)

高丹草是高粱(Sorghum bicolor)与苏丹草(Sorghum sudanense)的种间杂交后代，具有高粱鲜草产量高、抗逆性强和苏丹草叶量大、品质好等优良特性，其不足点是鲜草中含有氢氰酸［1-3］。有研究表明，高丹草品种间氢氰酸含量差异较大，含量高的品种(株高约100 cm时茎叶鲜草氢氰酸含量≥100 mg/kg)家畜采食量大时会出现中毒现象，给生产带来严重损失［4-6］。选育青刈饲喂安全的超低氢氰酸含量(株高约100 cm时茎叶鲜草氢氰酸含量1～15 mg/kg，青刈后可直接饲喂家畜)高丹草新品种是预防氢氰酸危害的有效措施。

为培育青刈饲喂家畜安全的超低氢氰酸含量高丹草新品种，近年来我们利用在内蒙古中西部地区种植多年的氢氰酸含量低的散穗高粱与黑壳苏丹草、白壳苏丹草、红壳苏丹草和棕壳苏丹草相组配进行人工授粉杂交，获得4个杂交组合的F1代，通过ISSR分子标记辅助选育，得到4个超低氰氢酸含量高丹草新品系SLCN-11(散穗高粱×黑壳苏丹草F5)、SLCN-12(散穗高粱×白壳苏丹草F5)、SLCN-13(散穗高粱×红壳苏丹草F5)、SLCN-14(散穗高粱×棕壳苏丹草F5)［7-10］。SSR(simple sequence repeats，简单重复序列)为共显性标记，具有多态性丰富、重复性好等优点，已广泛应用于牧草和作物的遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位及分子标记辅助育种［11-14］。目前，国内外有关SSR标记技术在高丹草品种或品系鉴定方面的应用尚未见有研究报道。本试验以我们育成登记的高丹草品种蒙农青饲3号为对照［15］，重点对上述4个高丹草新品系及其亲本进行SSR分析，以明确其在DNA水平上的差异程度，并建立高丹草新品系的SSR指纹图，为下一步高丹草新品种育成及登记利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料为4个高丹草新品系SLCN-11(散穗高粱×黑壳苏丹草F5)、SLCN-12(散穗高粱×白壳苏丹草F5)、SLCN-13(散穗高粱×红壳苏丹草F5)、SLCN-14(散穗高粱×棕壳苏丹草F5)及母本散穗高粱和父本黑壳苏丹草、白壳苏丹草、红壳苏丹草、棕壳苏丹草，对照品种为蒙农青饲3号高丹草(Sorghum bicolor×Sorghum sudanense cv.Mengnong Qingsi No.3)。各供试材料的种子由内蒙古农业大学农学院饲用作物育种研究室提供，试验于2012年7月至2013年5月在室内进行。

1.2 总DNA提取与纯度检测

将各供试材料的种子播种在花盆中，室温条件下培养成苗，在三叶期每种材料随机剪取20个单株幼苗的叶片混合，用植物基因组试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，取5 μL DNA用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，将各材料的DNA浓度稀释至50 ng/μL置冰箱中冷冻保存备用。

1.3 SSR-PCR扩增反应

扩增反应体系:反应液总体积为 20 μL，其中 ddH2O 11.6 μL，10 × Buffer 2.0 μL，Mg2+1.6 μL，dNTP 1.6 μL，Taq 酶 0.2 μL，上游引物 1.0 μL，下游引物 1.0 μL，60 ng/μL 的模板 DNA 1.0 μL。

扩增反应程序:在Eppendorf Mastercycler 5331-PCR仪上，95℃变性4 min，1个循环;94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，34个循环;72℃延伸10 min，1个循环后终止反应。

聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测:扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，每样品点样8 μL，电泳时间2 h。胶板在0.15%AgNO3溶液中银染15 min，取出后蒸馏水速漂5 s，放入含有3%NaOH和0.5%甲醛的溶液中显色10 min，视条带清晰后转入固定液终止反应，蒸馏水清洗2 min后晾干、扫描。

1.4 SSR适宜引物的筛选

利用已开发的同属植物高粱的200对SSR引物进行筛选(http://algodon.tamu.edu/sorghumdb.html提供的引物序列，由上海生物工程公司合成)，选出多态性丰富的适宜引物，用于PCR扩增。试验重复5次。

1.5 SSR分子标记的数据处理

将染色好的胶板放在透射光灯箱上，记录胶板上清晰的条带，电泳结果采取0/1赋值记带，将所观察到的每一条带视为1个单位，有带记为1，无带记为0，生成0，1组成的数据矩阵，进行统计分析，并计算下列相关遗传系数［16］。

多态性位点百分率:对于某一位点而言，当变异个体频率大于0.01时，该位点即为多态性位点(P):P=(K/N)×100%，式中，K为多态性位点数目、N为扩增位点总数。

供试材料的遗传相似系数(GS)和遗传距离(GD):GS=2Sij/(Si+Sj)，式中，Sij为材料i和材料j共有的条带数目，Si+Sj为2种材料中出现的条带数目之和;GD=1－GS。根据类平均法，运用DPS V 8.01分析软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 供试材料基因组DNA质量检测

用植物基因组试剂盒提取10个供试材料基因组DNA的电泳条带清晰、可辨、均匀且无拖尾现象，表明所提取的DNA纯度高，完全能满足SSR分析的要求(图1)。

图1 供试植物基因组DNA电泳检测Fig.1 The electrophoresis of genomic DNA of tested plants

2.2 SSR 扩增结果

以4个高丹草新品系 SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13、SLCN-14和其亲本散穗高粱、黑壳苏丹草、白壳苏丹草、红壳苏丹草、棕壳苏丹草及蒙农青饲3号高丹草基因组DNA为模板，从200个SSR引物中筛选出条带清晰、稳定性好、多态性丰富的适宜引物12对(表1)，用于10个供试材料基因组DNA的PCR扩增，共得到576个SSR位点，其扩增片段长度多在200～2500 bp之间，平均每对引物扩增出48个，多态性位点509个，多态性百分率达87.3%。在12对引物中，以引物Xtxp 7扩增的总位点数和多态性位点数最少，分别为26和18个，引物Xtxp 96扩增的多态性位点百分率最高，为100%(表2)。

表1 SSR分析所用引物及其碱基序列Table 1 Primers and their nucleotide sequences used for SSR analysis

此外，每对引物扩增的SSR指纹图均可以清晰地将10个供试材料区别开来，这可为高丹草新品系鉴定及下一步新品种育成登记和知识产权保护利用提供DNA分子依据(图2～4)。

表2 供试植物SSR引物及扩增结果Table 2 SSR amplification results of tested plants

2.3 遗传距离和聚类分析

10个供试材料间的遗传距离(GD)变幅在0.3165 ～0.6692 之间，平均为0.5359(表3);以 GD 值0.50为基准，10个材料大体分为5类:蒙农青饲3号、散穗高粱、SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13 为一类;SLCN-14、棕壳苏丹草为一类;白壳苏丹草、黑壳苏丹草、红壳苏丹草各单独为一类(图5)。

3 讨论

植物远缘杂交是实现不同物种间基因交流和创造新种质(新物种、新品种)的重要途径［17-18］。本试验用育成登记的高丹草品种蒙农青饲3号作对照，将散穗高粱与黑壳苏丹草、白壳苏丹草、红壳苏丹草和棕壳苏丹草种间远缘杂交获得的4个低氰含量高丹草新品系SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13、SLCN-14［9-10］和其亲本间的遗传差异及亲缘关系进行SSR分析显示，各供试材料间的遗传距离(GD值)平均为0.5359，遗传差异较大;10个材料聚为3类，其中在第1类的5个材料中，包含了3个母本遗传背景均为散穗高粱的新品系SLCN-11、SLCN-12和SLCN-13，新品系SLCN-14与其没有杂交关系的棕壳苏丹草聚在一起，另外3个父本材料黑壳苏丹草、白壳苏丹草和红壳苏丹草各单独为一类，即部分遗传背景相同或不同的杂交新品系并没有表现出明显的聚类规则。这说明高粱和苏丹草种间杂交育成的新品系实现了亲本间基因的复杂交流，打乱了其亲本原有的基因次序，组合形成了新的基因型，这可能是高丹草杂交新品系杂种优势强的重要分子依据。

图2 引物xtxp61的SSR指纹图Fig.2 SSR fingerprint amplified by the primers xtxp61

图3 引物xtxp69的SSR指纹图Fig.3 SSR fingerprint amplified by the primers xtxp69

图4 引物ZCT339的SSR指纹图Fig.4 SSR fingerprint amplified by the primers ZCT339

表3 供试植物的遗传距离矩阵Table 3 The genetic distance matrix of tested plants

由于高丹草目前还没有开发出SSR引物，若单独开发成本高，故本试验从网上公布 (http://algodon.tamu.edu/sorghumdb.html)的200个普通高粱(近源同属植物)的SSR引物中，筛选出多态性丰富、条带稳定的12对引物进行了PCR扩增和位点分析，由于这些引物在普通高粱上扩增的SSR位点数目等表现情况目前还未见有研究报道，尚难与本试验结果进行比对，但本试验所用的母本材料散穗高粱是高粱属的一种，从12对引物扩增的电泳图片可知，由于引物不同其位点数不同，总体看散穗高粱的SSR位点数较多，它们与其余9个供试材料的SSR位点数和条带位置存在着一定的差异，而且每对引物扩增的SSR指纹图均可将10个供试材料区分开来，说明同属近缘种普通高粱的SSR引物用于高丹草新品系在DNA水平上鉴定是可行的。

本试验采用植物基因组试剂盒提取各供试植物基因组DNA的质量很高，但在试验中应注意样品经液氮处理后要迅速研磨成粉末状，且要避免长时间放置研好的样品，否则会影响DNA的提取效果，甚至导致DNA提取失败。另外，在聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)制备过程中，加速剂TEMED应最后加入，并迅速充分混匀、立即匀速灌胶，否则会导致同一胶板电泳速度不一致，出现非水平的条带而影响试验结果。

图5 10个供试植物的SSR聚类图Fig.5 The SSR dendrogram of 10 tested plants

4 结论

试验筛选出SSR适宜引物12对，PCR扩增10个材料的基因组DNA共得到509个多态性位点，多态性百分率达87.30%。每对引物扩增的SSR指纹图清晰、稳定，是识别4个低氰含量高丹草新品系及其亲本的重要分子依据。供试材料间的GD值变幅为0.3165～0.6692，以GD值0.50为基准，10个材料划分为5类:蒙农青饲3号、散穗高粱、SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13为一类;SLCN-14、棕壳苏丹草为一类;白壳苏丹草、黑壳苏丹草、红壳苏丹草各单独为一类。

［1］詹秋文，钱章强.高粱与苏丹草杂种优势利用的研究［J］.作物学报，2004，30(1):73-77.

［2］李源，谢楠，赵海明.不同高丹草品种对干旱胁迫的响应及抗旱性评价［J］.草地学报，2010，18(6):891-896.

［3］赵晓杰，于卓，刘永伟，等.高粱314A、13A与苏丹草杂种F1代的农艺特性及细胞学分析［J］.西北植物学报，2005，25(6):1107-1113.

［4］于卓，赵晓杰，赵娜，等.蒙农青饲2号高丹草选育［J］.草地学报，2004，12(3):176-182.

［5］于卓，刘永伟，赵晓杰，等.高粱11A与3种苏丹草杂交种F1的农艺特性及细胞遗传学研究［J］.草业学报，2006，15(1):90-96.

［6］汪建飞，段立珍，罗自琴.杂交苏丹草中CN－含量的测定［J］.草业学报，2002，11(1):43-46.

［7］周亚星.超低氢氰酸高丹草新品系分子标记辅助选育研究［D］.呼和浩特:内蒙古农业大学，2010.

［8］周亚星，于卓，马艳红，等.散穗高粱与苏丹草杂种的ISSR分析［J］.草地学报，2009，17(6):718-722.

［9］周亚星，于卓，房永雨，等.超低氢氰酸高丹草新品系选育及ISSR分子标记验证［J］.中国草地学报，2012，34(3):16-11.

［10］周亚星，于肖夏，于卓，等.高丹草超低氢氰酸含量ISSR特征片段的克隆及序列分析［J］.中国草地学报，2012，34(6):75-80.

［11］罗冉，吴委林，张旸，等.SSR分子标记在作物遗传育种中的应用［J］.基因组学与应用生物学，2010，29(1):137-143.

［12］朱彩梅，张京.应用SSR标记分析中国糯大麦种质的遗传多样性［J］.植物遗传资源学报，2010，11(1):57-64.

［13］卢玉飞，蒋建雄，易自力.玉米SSR引物和甘蔗EST引物在芒属中的通用性研究［J］.草业学报，2012，21(5):86-95.

［14］吴元奇，郑灵，荣廷昭.西南地区白玉米地方种质资源分布及遗传多样性［J］.草业学报，2013，22(4):160-169.

［15］于卓，马艳红，李小雷，等.蒙农3号高丹草选育［J］.中国草地学报，2008，30(6):1-9.

［16］Nei M，Li W.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］.Proceedings National A-cademy Sciences USA，1979，76:5269-5273.

［17］邓衍明，叶晓青，佘建明，等.植物远缘杂交育种研究进展［J］.华北农学报，2011，26(增刊):52-55.

［18］戴华军，朱正斌，沈雪林，等.作物远缘杂交育种的途径及其实质［J］.基因组学与应用生物学，2010，29(1):144-149.