高寒草甸魏斯氏乳酸菌的分离鉴定及理化特性研究

杨杨，石超，郭旭生，3*

(1．兰州大学草地农业科技学院草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州730020;2．兰州大学生命科学学院草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州730000;3．兰州大学青藏高原生态系统管理国际中心，甘肃兰州730000)

草地畜牧业作为青藏高原传统的基础产业在其经济发展中具有重要的地位，也是青藏高原今后经济发展的支柱产业之一。但是，长期以来天然草地饲草料供给的季节性不平衡，严重制约着青藏高原草地畜牧业的高效发展，加之长期的超载过牧，草地退化，使草畜矛盾日益突出［1-3］。通过人工种草和天然草地打草来制作青贮饲料，将是解决高寒草地畜牧业冬春季节饲草料严重不足的有效措施之一。乳酸菌在饲料工业中，尤其在青贮饲料的制备领域中有着重要的作用。在很多国家特别是欧美等发达国家已经对乳酸菌在青贮饲料制备中的应用进行了大量而深入的研究。其研究内容主要包括性状优良乳酸菌的筛选，乳酸菌对青贮饲料发酵品质的影响，添加乳酸菌的青贮饲料对奶牛采食量的影响以及乳酸菌对青贮饲料二次发酵的抑制作用等［4］。而在用于饲料青贮的乳酸菌的筛选及其对青贮饲料发酵品质影响的基础应用研究、产品开发等方面日本和欧美国家处于领先地位，但我国乳酸菌在青贮饲料中的研究主要是利用国外商品化的乳酸菌制剂进行试验［5-6］，对具有自主知识产权的乳酸菌制剂的研究与开发很少。然而，我国青藏高原地区的极端气候环境，使得传统商品化乳酸菌在该地区的应用受到了限制，因为商品化乳酸菌制剂的适宜生长温度通常为20～25℃。因此，发掘利用高寒地区乡土乳酸菌种质资源，对于在该地区制作青贮饲料具有重要的意义。

近几年，有关青藏高原乳酸菌的多样性与种质资源的研究，逐渐引起了国内外学者的关注，这方面的研究主要涉及食品学科并集中于高原传统发酵乳制品中乳酸菌的分离与鉴定［7-13］。国内有关牧草中天然附着乳酸菌分离鉴定及其在青贮饲料中的筛选研究与应用方面起步较晚，最近几年才开始有报道［4，14-16］，而且关于青藏高原高寒地区牧草中附着乳酸菌的研究还无人涉及，只有相关研究表明，在我国高寒地区高海拔、低温和缺氧的极端环境中进行牧草青贮时能够得到优质的青贮饲料。青贮饲料色绿，酸香味浓，适口性好，几乎没有二次发酵的现象［17-18］。这说明在我国青藏高原高寒地区依然存在着能够在极端环境中发酵饲料的特殊乳酸菌菌群。在西藏高寒地区，以藏北嵩草(Kobresia littledalei)为优势种的草地型是全区高寒沼泽化草甸亚类草地中分布范围广、面积大、牧草饲用价值较高的草地型［19-20］。因此，本试验以藏北嵩草为原料，对其附着乳酸菌进行分离、鉴定和生物学特性研究，为筛选青藏高原青贮饲料用优良乳酸菌种质资源提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 样品采集

用于分离乳酸菌的试验样品藏北嵩草于2010年7月初分别采自西藏纳木错高寒草甸草地(海拔5100 m;东经90°42'，北纬 29°58');那曲古露镇高寒草甸(海拔 4582 m;东经 91°37'，北纬 30°50');堆龙德庆的高寒草甸(海拔3980 m;东经90°49'，北纬29°57')。样品采集地点的气候属于高山亚寒带半干旱季风气候。试验地堆龙德庆乡年均降雨量为444 mm，年均气温7℃，年平均日照时数3000 h;纳木错采样区年平均温度－0．6℃，年降雨量456．8 mm，年最高温在7月份，为14．6℃，该地区日照时数2880 h;样品采集点古露镇年平均气温－1．3℃，年内最高温度在7月份，为9．1℃，年平均降雨量为421．9 mm，该地区年平均日照时数为2846 h。样品采集地点牧草生长期为5月中旬至9月底，土壤类型均为高山草甸土。每个采样点设置10个1 m×1 m样本框分别进行采样。

牧草样品剪取后，装入塑料袋，冰盒中冷藏，带回实验室，－20℃保存，以备附着微生物检测。

1．2 培养基

试验用培养基参考凌代文［21］的方法配制。

葡萄糖酵母蛋白胨(GYP)培养基:蛋白胨2 g，酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，吐温－80 0．25 g，MgSO4·7H2O 0．1 g，MnSO40．1 g，FeSO40．1 g，NaCl 5 g，CaCO35 g，加蒸馏水至 1000 mL，调 pH 6．8，121℃灭菌 15 min。

MRS培养基:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，K2HPO45 g，柠檬酸铵2 g，乙酸钠5 g，MgSO4·7H2O 0．58 g，吐温 －80 1 mL，MnSO40．25 g，CaCO320 g，琼脂粉20 g，加蒸馏水至1000 mL，调 pH 6．2 ～6．4，121℃灭菌15 min。不加琼脂粉即可得到MRS培养液。

PYG培养基:PY基础培养液内加入1．0 g葡萄糖。PY基础培养基为蛋白胨0．5 g，胰酶解酪朊0．5 g，酵母提取物 1．0 g，盐溶液 4．0 mL，蒸馏水 100 mL。其中盐溶液为无水氯化钙 0．2 g，MgSO4·7H2O 0．48 g，磷酸氢二钾 1．0 g，磷酸二氢钾 1．0 g，碳酸氢钠 10．0 g，氯化钠 2．0 g，蒸馏水 1000 mL。

1．3 乳酸菌的分离与纯化

在无菌室中，将嵩草样品剪成1 cm左右的短段，并称取10 g分别置装有90 mL灭菌生理盐水的三角瓶中，常温摇床4～6 h。用已灭菌的生理盐水适当稀释，选2个稀释度，每个稀释度取0．1 mL菌种稀释液滴到GYP(含有碳酸钙)平板上，用涂布棒将其涂布均匀后，将平板在37℃厌氧培养48 h。之后，根据菌落的颜色、大小、光泽、透明程度等，挑取有透明圈的单菌落，进行革兰氏染色、油镜镜检和过氧化氢酶试验，凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株疑似其为乳酸菌并以划线的方式在MRS培养基上继续分离纯化培养2次。将纯化后的菌株接种到MRS斜面培养基上培养后，在4℃条件下保存备用。

1．4 菌种鉴定

1．4．1 属的鉴定 按照凌代文［21］、杨洁彬等［22］、东秀珠和蔡妙英［23］介绍的方法，将所有革兰氏阳性，过氧化氢酶试验阴性的分离菌株初步鉴定为乳酸菌。之后根据菌种的形态学特征将其分为杆菌和球菌，并根据凌代文［21］的方法进行乳酸菌属的初步鉴定试验。

1．4．2 种的鉴定 乳酸菌种的鉴定参考凌代文［21］的方法。通过糖发酵试验进行乳酸菌种的鉴定，采用杭州天和生化有限公司提供的糖发酵试剂盒。具体方法按照试剂盒的说明进行。

1．4．3 乳酸菌的16S rRNA序列测定 分离的乳酸菌在MRS培养基中培养8 h后进一步纯化并进行菌株DNA的提取。DNA提取试剂盒由天根生化试剂(北京)有限公司提供。DNA的提取及纯化按照试剂盒使用方法进行。分离单菌DNA做模板，采用引物57 F:5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和205 R:5'-CTTGTTACGACTTCACCC-3'进行 PCR 扩增;反应系为(50 μL):DNA 模板2 μL，57 F 1 μL，205 R 1 μL，2×Master Mix 25 μL，ddH2O 21 μL。反应程序为:94℃ 30 min;94℃ 30 s，60 ～50℃，30 s(每个循环降 1℃)，72℃ 1．5 min，10 个循环;94℃30 s，50℃30 s，72℃1．5 min，30个循环;72℃5 min。PCR纯化产物进行测序(北京博迈德科技发展有限公司)。

1．5 生长特性检测

1．5．1 乳酸菌生长速率的测定 用待测菌株的培养液，以相同的接种量(0．1 mL)接入MRS液体培养基中，于30℃厌氧培养箱中培养24 h，每隔2 h取样品，用紫外可见分光光度计(日立，U-2910)以培养基为空白，在波长620 nm下立即测定样品的吸光度值，并按照下列公式计算菌株的生长速率。

菌株的生长速率=液体培养基各时间点的OD值－液体培养基的起始OD值。

1．5．2 乳酸菌产酸速率测定 将待测菌液分别接种于MRS液体培养基中，于30℃厌氧培养箱中培养24 h，每隔2 h取样品，用pH计(上海精科，PHS-3C)检测培养液pH值，并按照下列公式计算菌株的产酸速率。

产酸速率=培养基中起始pH－各时间点pH。

1．5．3 不同温度条件下生长特性 将配制好的MRS培养液以5 mL量分装试管，121℃高压灭菌15 min，将试验菌株以相同的接种量(0．1 mL)接入培养液中，摇匀，塞子封口，各设2个重复，温度为4℃放在冰箱中，10，15，25，30℃放在恒温培养箱中，40，50，60℃的放在水浴锅中分别培养，其中4℃培养14 d，40，50和60℃培养7 d，其余培养2 d，观察菌株的生长情况。

本节将验证PUs与SUs同时存在于CRN时，几种频谱资源分配算法性能对比.在网络中部署4个PUs，分别位于(30,30)(30,70)(70,30)和(75,30)处，干扰半径均为30m，以概率θ分别对信道1、2、3和1独占使用，则信道空闲概率为μ=1-θ.

1．5．4 不同pH条件下生长特性 所用培养基是将MRS培养液用盐酸或氢氧化钠调pH至所需酸碱度，即pH分别为3，4，4．5，5，6，7，8，9，9．5 的 9 种 MRS 液体培养基，同上步骤，将试验菌株的培养液，以相同的接种量(0．1 mL)接入装有已灭菌培养基中，各设2个重复，置于37℃恒温培养箱培养2 d后，观察菌株的耐酸碱能力。

1．6 数据统计分析

不同乳酸菌菌株生长速率及产酸速率利用SPSS 19．0进行单因素方差分析和多重比较。根据乳酸菌的16S rDNA序列，在Genbank中进行比对，分析相似性。乳酸菌16S rRNA序列用MEGA 5．0中的Clustal W对最近类群的序列进行多重比较分析，并通过该软件的邻近法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，分支聚类的稳定性用Bootstrap方法进行100次随机重复取样评价［13］。

2 结果与分析

2．1 藏北嵩草分离魏斯氏乳酸菌的16S rRNA基因序列分析

采用16S rRNA测序结果表明(表1)，从西藏德庆、那曲古露和纳木错高寒草甸藏北嵩草中共分离出17株魏斯氏乳酸菌。其中从德庆、那曲古露及纳木错藏北嵩草中各分离出9，3及5株菌。这些菌种属于魏斯氏乳酸菌的2个种，即食窦魏斯氏乳酸菌(Weissella cibaria)和融合魏斯氏乳酸菌(Weissella confusa);而且有10个菌株与Genbank中的标准菌株食窦魏斯氏菌II-I-59(W．cibaria II-I-59)和融合魏斯氏菌JCM 1093(W．confusa JCM 1093)的相似率均为99%。通过进一步对2种魏斯氏乳酸菌菌种相似菌株的16S rRNA基因序列进行多重比较分析和系统发育树的构建(图1)，鉴定出所分离的17株魏斯氏乳酸菌菌株有6株为食窦魏斯氏乳酸菌，11株为融合魏斯氏乳酸菌菌株。

2．2 藏北嵩草分离魏斯氏乳酸菌的生长特性

不同海拔地区藏北嵩草附着魏斯氏乳酸菌的生长特征见表2。从分离菌株在不同温度的生长情况来看，这些菌株均能够在4和10℃生长。在不同pH值条件下的生长情况表明，菌株D7，D9和N2，N3，N4能在pH值为3的条件下生长，而且大多数菌株能在pH值为4～9．5的范围内生长。

分离乳酸菌的糖发酵试验结果见表3。从表3看出，除了菌株N2外，所有的菌株都发酵阿拉伯糖。发酵半乳糖的结果表明，有15个魏斯氏菌株可发酵利用半乳糖，而菌株D2和D7为可变的反应。所有的菌株均能利用纤维二糖，麦芽糖，果糖，蜜二糖和蔗糖。菌株D4，G3，以及N2～N5均能发酵核糖，而菌株D1，D2和D9不利用核糖，其余菌株为可变的反应;从利用棉籽糖的情况来看，菌株D6，N1，N2，N3不发酵棉籽糖。根据魏斯氏乳酸菌的糖发酵鉴定方法，食窦魏斯氏乳酸菌发酵阿拉伯糖，不发酵半乳糖和木糖。但本试验中所分离菌株的糖发酵试验结果表明，只有菌株D7利用半乳糖为可变反应，其余5株食窦魏斯氏乳酸菌(D3，D8，D9，N1，N3，N4)均能发酵利用半乳糖。而16S rRNA序列分析结果表明，菌株D2，D4，D5，D6及G1，G2和N2，N3与融合魏斯氏乳酸菌的相似性均为100%，并结合系统发育分析结果(图1)，菌株D1，D8和G2均为融合魏斯氏乳酸菌。

表1 藏北嵩草附着魏斯氏乳酸菌菌株的16S rRNA基因序列分析结果Table 1 Results of 16S rRNA gene sequences of strain isolated from K．littledalei

2．3 藏北嵩草分离魏斯氏乳酸菌的产酸及生长特性

藏北嵩草附着魏斯氏乳酸菌的产酸速率见表4。17株魏斯氏乳酸菌培养6 h后，菌株D4的产酸速率最快，其培养基中pH比起始培养基的pH下降了1．38，且显著高于其他菌株的产酸速率(P＜0．05)。培养12 h后，菌株G1培养基中的pH最低，比起始pH降低了2．09，且显著高于其他菌株的产酸速率(P＜0．05)。培养18 h后，菌株N1培养基中的pH最低，显著高于其他菌株的产酸速率(P＜0．05)，且比起始pH降低2．46。同时，该菌株在培养24 h后，其产酸速率也最大。

图1 藏北嵩草分离魏斯氏乳酸菌的系统发育分析Fig．1 The phylogenetic analysis of the Weissella lactic acid bacteria isolated from K．littledalei

3 讨论

魏斯菌属(Weissella)是1993年Collins等提议建立的一个新菌属，目前至少由12个菌种组成［24］。该乳酸菌不形成芽孢，无动力的革兰阳性球菌或球杆菌，呈单个、成双或短链状排列。这类乳酸菌广泛分布于发酵食物(如腊肠、泡菜)、土壤等，多数菌种在植物发酵中起重要作用［24］。在青贮饲料中报道的魏斯氏菌主要为类肠膜魏斯菌(W．paramesenteroides)，并在青贮饲料发酵初期起重要作用，但研究表明这类乳酸菌在提高青贮饲料品质方面作用较小［25］。

表2 藏北嵩草附着魏斯氏乳酸菌在不同温度和pH条件下的生长特性Table 2 G row th profiles of Weissella strains isolated from K．littledalei at different tem perature and pH

表3 藏北嵩草附着魏斯氏乳酸菌的糖发酵特性Table 3 Sugar fermentation profiles of Weissella strains isolated from K．littledalei

魏斯菌属细菌可分离于多种来源。但在高寒极端环境中分离的魏斯氏乳酸菌还未见报道。本研究从高寒地区藏嵩草中分离的魏斯氏乳酸菌，通过16S rRNA序列分析表明，主要为食窦魏斯氏乳酸菌和融合魏斯氏乳酸菌。从目前的研究资料来看，仅见这2种菌分离于人类或其他动物的报道［26-27］。研究表明，这2种菌很难从形态特征及菌落特征方面区别;食窦魏斯氏菌发酵阿拉伯糖，不发酵半乳糖和木糖，可区别于融合魏斯氏菌［24］，因为融合魏斯氏菌不发酵阿拉伯糖、蜜二糖和棉籽糖，但发酵半乳糖、纤维二糖、麦芽糖、核糖等［21］。但本试验的研究结果表明，从藏嵩草中分离的融合魏斯氏菌除了菌株N2外，其他菌株菌发酵阿拉伯糖，而且分离鉴定的食窦魏斯氏乳酸菌均能利用半乳糖。这可能是高寒环境中魏斯氏乳酸菌对碳源的利用比其他环境中分离出的菌种更具有广泛性。

由于青藏高原高寒环境的特殊性，从藏嵩草中分离的乳酸菌能够在4℃的条件下生长，而且在10℃时生长活力旺盛，体现出高寒环境中分离出的乳酸菌对低温的适应特性。这对高寒低温条件下，应用分离出的耐低温乳酸菌进行青贮饲料的发酵提供了保障和科学依据，对于低温环境中青贮饲料的调制具有重要的意义。另外，本试验结果表明，菌株D7，D9和N2，N3，N4能在pH为3的条件下生长，体现出这些菌株具有强的耐酸性能力。从本试验分离出的17株融合魏斯氏乳酸菌的生长特性及产酸能力来看，菌株D4和G1分别在培养6和12 h时，产酸

速率显著高于其他菌株，可作为饲料青贮时，青贮饲料发酵启动菌株的备选菌株。而菌株N1在培养18至24 h后，其产酸速率均显著高于其他菌株。这一特性将对青贮饲料后续发酵起到重要的作用。上述菌株的产酸速率特性，可为青贮饲料发酵菌株的科学合理配伍提供依据。而从生长速率来看，所分离的菌株与其产酸能力并不对应。说明生长速率快的菌株，其产酸能力不一定强。为此，在筛选饲料青贮用乳酸菌菌株时，应以产酸速率为依据。

表4 藏北嵩草附着魏斯氏乳酸菌的产酸速率Table 4 Acid production rate of Weissella strains isolated from K．littledalei

表5 藏北嵩草附着魏斯氏乳酸菌的生长速率Table 5 Grow th rate of Weissella strains isolated from K．littledalei

4 结论

本试验首次报道了从牧草(高寒藏北嵩草)中分离出魏斯氏乳酸菌。分离出的融合魏斯氏乳酸菌菌株具有耐低温，耐酸性强，发酵碳源广泛的特征。这一结果对于今后在我国青藏高原高寒环境中分离具有特殊发酵性能的乳酸菌以及利用这些乳酸菌菌株进行低温环境中青贮饲料的调制提供了重要的科学依据。本试验分离魏斯氏乳酸菌菌株对青贮饲料发酵模式及品质的影响将做进一步研究。

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