幽门螺杆菌Tipα蛋白对巨噬细胞凋亡的影响

伍美兰，刘胜，钟轶，杨晓春，刘丽维，张艳

（1.南华大学病原生物学研究所，湖南 衡阳 421001 E－mail：wumeilanh＠126.com；2.湖南省邵阳医学高等专科学校附属医院检验科，湖南 邵阳 422000）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是寄生于胃黏膜上皮细胞间沟及胃小凹内地一种革兰阴性细菌。Hp在人群中的感染率很高，尤其是在发展中国家，其感染率可达80%。Hp是引起胃黏膜疾病以及胃癌的重要病原体，其致病因素可能与黏膜表面炎症反应、分泌毒力蛋白等因素有关。肿瘤坏死因子α诱导相关蛋白（Tipα）是近年发现的一个新的毒力蛋白。研究发现，Hp的致病与Tipα关系密切［1－2］。本研究旨在观察Tipα对巨噬细胞细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 无内毒素的Tipα重组蛋白为本课题组制备。Annexin－V－FITC－PI检测试剂盒，Caspass－3、Caspase－9活性检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司。细胞色素C ELISA 检测试剂盒购自欣博盛生物有限公司。THP－1 细胞购自中科院上海细胞库。

1.2 细胞培养与处理 人单核细胞THP－1 采用RPMI－1640培养基培养，并用PMA 诱导分化成巨噬细胞。置于37℃、5%CO2环境中培养。待细胞生长满孔底90%左右时，加入0、5、10、30、50μg／ml Tipα作用24h。

1.3 流式细胞术分析 流式细胞仪检测：激发波长Ex＝488 nm，发射波长Ex＝530nm；Annexin V－FITC 绿色荧光通道（FL1）检测，PI红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门位置。

1.4 Caspase－9、Caspase－3活化程度的检测 按照试剂盒操作步骤进行。裂解处理后细胞，吸取50μl（含100～200μg）蛋白，加入等体积2×Reaction Buffer和5μl Caspase－9Substrate／Caspase－3Substrate并于37 ℃避光孵育4h。在λ＝405nm 处测定其吸光值。通过计算OD 诱导组／OD 阴性对照的倍数来确定Caspase－9、Caspase－3活化程度。……