复合防腐剂对百合青霉病抑制效果的研究

李渐鹏，胡林刚，李永才*，毕 阳，葛永红，王 毅

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

复合防腐剂对百合青霉病抑制效果的研究

李渐鹏，胡林刚，李永才*，毕 阳，葛永红，王 毅

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken二次多项式回归方程模型进行响应面分析，研究硅酸钠、硼砂、壳聚糖复合处理组合对百合鳞茎青霉病的控制效果。结果表明：3种单一试剂均能有效地控制百合鳞茎青霉病的扩展，对病斑直径的影响程度依次为：硅酸钠＞壳聚糖＞硼砂，复合处理组合202 mg/L硅酸钠＋0.98 g/100 mL硼砂＋0.60 g/100 mL壳聚糖的抑制效果最好，病斑直径仅为对照组的51%，显著地抑制了青霉病的扩展。

百合鳞茎；青霉病；防腐剂；响应面分析

百合（Lilium）是百合科百合属多年生草本植物，在我国可食用的有宜兴百合、龙牙百合及兰州百合3个品系，其中兰州百合以其鳞茎肉厚、洁白香甜，含糖量高、粗纤维低而著名，深受人们青睐[1]。但百合鳞茎在贮藏期间极易受病菌侵染造成腐烂变质、贮藏时间短，其中由圆弧青霉（Penicillium cyclopium）引起的青霉病最为严重[2]。目前百合多采用－3 ℃冷库低温贮藏或化学合成药物处理降低采后病害[3-5]。然而，长期大量使用化学药剂不仅会使病原菌产生抗药性，而且会造成农药残留，不但威胁着人类的健康，而且严重污染环境。因此，开发安全环保的新型防腐剂以代替化学杀菌剂来防治果蔬的病害已势在必行。

近年来，硅酸盐、硼酸盐和壳聚糖作为一种新型的安全防腐剂逐渐被应用于果蔬采后商品化处理。采后硅酸钠处理不仅可以有效抑制厚皮甜瓜的多种采后病害[6-7]，减轻梨果黑斑病和青霉病[8-10]以及马铃薯块茎的干腐病[11-12]，还可以有效地控制柑橘的青霉病[13]。近期研究表明硼酸钾可有效地控制灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的鲜食葡萄的采后灰霉病[14]，同时硼酸钠显著抑制核果链核盘菌（Monilinia laxa）菌丝的生长，并且浓度越高抑制效果越好[15]。壳聚糖具有无毒、成膜好、抗菌范围广等特点，在果蔬保鲜方面受到高度的重视[16-18]。目前已在马铃薯[19]、杏[20]等果蔬的采后病害控制中进行了研究和应用。

硅酸钠、硼砂和壳聚糖作为代替化学合成杀菌剂的安全防腐剂在果蔬采后病害控制中均具有潜在的应用前景，但各自作用机理存在差异，硅酸钠和硼砂主要通过直接抑制病原物的生长控制病害，而壳聚糖既具有杀菌作用又具有诱抗作用，同时其单独处理均不能完全有效地控制病害的扩展。因此为充分发挥各自的作用效果，减少使用剂量和降低成本，本实验通过单因素和响应面试验设计，研究硅酸钠、硼砂和壳聚糖复合处理对兰州百合鳞茎青霉病的控制效果，确定其最佳处理组合，以期为百合鳞茎青霉病的安全控制提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百合鳞茎采自兰州七里河区西果园乡，采后放置在－2 ℃冷库中保藏。

硅酸钠、硼砂、壳聚糖均为分析纯 天津光复公司。

圆弧青霉（Penicillium cyclopium），在染病百合鳞茎上分离、纯化后保存备用。

1.2 仪器与设备

101-1型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；LDZX-30KB型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；S.SW-CJ-1FD型净化工作台 上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基的制作

参照方中达[21]的方法制作马铃薯琼脂培养基：马铃薯200 g/L、蔗糖20 g/L、琼脂17～20 g/L。将马铃薯切成大约1 cm2的小方块，加水煮沸30 min后过滤。同时将蔗糖和琼脂分别溶解后与马铃薯过滤液混合，并定容1 000 mL，分装在三角瓶中进行高压灭菌。灭菌后制备平板培养基。

1.3.2 孢子悬浮液的配制

参照毕阳等[22]方法。取25 ℃培养7 d的P. cyclopium菌株培养皿1个，加入含0.05%吐温-80的无菌水约10 mL，收集病原菌孢子，用4层纱布过滤并转入已灭菌的三角瓶中，在振荡器上充分振荡，待孢子完全被打散均匀后，获得纯孢子悬浮液，经显微血球计数板计数确定孢子浓度，并稀释至1×106CFU/mL。

1.3.3 单因素试验

选择外观健康、瓣大肉厚的鳞茎，用自来水清洗干净后，在0.1%的次氯酸钠中浸泡20 s进行表面消毒，取出晾干，用1×106CFU/mL的P. cyclopium进行损伤接种，放置2 h后，分别在质量浓度50、100、150、200、250 mg/L的硅酸钠，0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g/100 mL的硼砂和0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g/100 mL的壳聚糖溶液中浸泡处理3 min。取出晾干，置于培养皿内于室温下保鲜膜覆盖保湿贮藏，6 d后测病斑直径。以蒸馏水处理作对照，每次处理用鳞茎40个，重复3次。

1.3.4 响应面试验设计

根据不同质量浓度试剂的单因素试验结果，选取硅酸钠（A）、硼砂（B）、壳聚糖（C）3个因素为自变量，以病斑直径为响应值，进行中心组合试验设计，每个试验重复3次，取其平均值，试验因素水平及编码见表1。将数据进行多元回归拟合，并对回归方程进行方差分析及拟合度检验，讨论模型所在响应面特征，预测响应值是否为极大值、极小值，或是鞍点。若为极值，则进行验证；若为鞍点，则进行脊岭分析，确定在何处进行实验可得到最好结果。

表1 响应面分析试验设计因素水平及编码Table 1 Factorial levels of Box Behnken design

1.3.5 模型验证

通过响应面法优化药物复合处理后百合鳞茎的病斑直径，并以优化后的最佳复合方式进行实验验证，比较模型预测值和实验值，验证模型的有效性。

1.4 数据分析

采用SPSS 8.1及Microsoft Excel 2003统计软件进行单因素方差分析和差异显著性分析，采用Design Expert 8.06软件进行响应面分析。每个实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 硅酸钠对青霉病斑直径的影响

图1 硅酸钠处理对百合鳞片青霉病病斑直径的影响Fig.1 Effects of sodium silicate treatment on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

由图1可知，除250 mg/L硅酸钠外，各质量浓度硅酸钠处理的百合鳞片病斑直径均低于对照（P＜0.05）。但各处理组对青霉病的控制效果并不存在质量浓度差异效应，其中200 mg/L的硅酸钠处理组控制效果最好，其病斑直径仅为对照的61.8%。而当处理质量浓度进一步提高到250 mg/L时，其病斑直径反而增高，这可能由于高浓度药物对百合产生了药害。王彩霞等[23]在研究不同质量浓度的醚菌酯对百合鳞茎青霉病的控制，同样发现125 mg/L的高质量浓度处理显著增加病害的发生率和病斑直径。

2.1.2 硼砂对青霉病斑直径的影响

图2 硼砂处理对百合鳞片青霉病病斑直径的影响Fig.2 Effects of sodium borate treatment on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

由图2可知，硼砂处理可有效降低损伤接种P. cyclopium的百合鳞茎的病斑直径，不同质量浓度的硼砂处理的控制效果存在差异。当质量浓度低于1.00 g/100 mL时，随着处理质量浓度的增加，其控制效果明显增加，且病斑直径均显著低于对照（P＜0.05），其中1.00 g/100 mL的硼砂处理控制效果最好，病斑直径为对照的89.1%。当质量浓度达1.25 g/100 mL时，其病斑直径虽仍显著低于对照（P＜0.05），但控制效果明显降低。

2.1.3 壳聚糖对青霉病斑直径的影响

图3 壳聚糖处理对百合鳞片青霉病病斑直径的影响Fig.3 Effects of chitosan treatment on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

由图3可知，随着壳聚糖质量浓度的升高，病斑直径逐渐减小，然而当质量浓度大于0.6 g/100 mL时，随着壳聚糖质量浓度的升高，病斑直径反而逐渐增大。其中0.60 g/100 mL的处理病斑直径最小，为对照的85%。这可能是较低质量浓度的壳聚糖诱导百合组织产生了抗病性，孙晓娟等[19]在研究壳聚糖对马铃薯块茎干腐病的控制时发现，较低质量浓度的壳聚糖能显著抑制病斑的扩展，而1.0 g/100 mL高质量浓度的壳聚糖处理块茎表皮出现了轻微的药害，病斑直径反而增大。

2.2 响应面试验设计与优化分析

2.2.1 响应面设计结果及显著性检验

在单因素试验的基础上，以硅酸钠(A)、硼砂（B）、壳聚糖（C）为自变量，以百合鳞茎青霉病斑直径（L）为响应值，设计三因素三水平的Box-Behnken响应面分析试验，如表2所示。

表2 响应面分析试验设计方案及结果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

表3 回归方程模型方差分析及其系数的显著性检验Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic model and significance test of the regression coefficients in it

应用Design Expert 8.0.6软件对表2的数据进行分析，获得回归模型为：

L=0.37－5.00A＋0.011B＋1.25C－0.038AB＋0.018AC＋5.00BC＋0.035A2＋0.063B2＋0.038C2。

由表3可知，经显著性检验可以看出，回归模型显著，R2为0.873 8，调整后R2为0.711 6，说明模型的拟合度较好，响应值的71.16%是由于所选变量引起，表明百合鳞茎病斑直径实际值与预测值之间具有较好的拟合相关性。模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，本试验模型失拟项的P值为0.250 2＞0.1，模型失拟项不显著，进一步说明此模型的拟合度良好。变异系数反映模型的置信度，值越低模型的置信度越高，本试验的变异系数为6.51%，说明模型方程能够较好地反映真实值。综合分析该模型拟合程度良好，故可使用该模型来分析和预测复合防腐剂的配方。对模型中的回归系数进行显著性检验可以看出，二次项中AB、A2、B2、C2对百合鳞茎病斑直径（L）有较显著影响（P＜0.05）。对回归方程中一次项系数的绝对值进行比较，各试验因素对病斑直径（L）的影响顺序为：硅酸钠＞壳聚糖＞硼砂。

2.2.2 交互作用分析

图4 硅酸钠和硼砂对百合鳞茎病斑直径的影响Fig.4 Effects of sodium silicate and sodium borate on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

从图4a可以看出，硅酸钠和硼砂存在着协同作用，即在一定的质量浓度区域内，只有两者同时升高或同时降低，才能降低病斑直径。当硅酸钠质量浓度为150～250 mg/L时，且硼砂质量浓度为0.80～1.10 g/100 mL时，百合青霉病斑直径有最小值0.36 cm。如图4b所示，两者之间等高线的形状呈椭圆形，表明交互影响作用显著。

图5 硅酸钠和壳聚糖对百合鳞茎病斑直径的影响Fig.5 Effects of sodium silicate and chitosan on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

从图5a可以看出，硅酸钠和壳聚糖同样存在着协同作用，即在一定的质量浓度区域内，只有两者同时升高或同时降低，才能降低病斑直径。当硅酸钠质量浓度为160～250 mg/L，且壳聚糖质量浓度为0.45～0.75 g/100 mL时，百合青霉病斑直径有最小值0.36 cm。如图5b所示，两者之间等高线的形状呈椭圆形，表明交互影响作用显著。

图6 硼砂和壳聚糖对百合鳞茎病斑直径的影响Fig.6 Effects of sodium borate and chitosan on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

从图6 a可以看出，壳聚糖质量浓度为0.40～0.80 g/100 mL时，病斑直径呈下降趋势，硼砂质量浓度0.75～1.25 g/100 mL时，病斑直径也呈下降趋势，两者之间没有显著的交互作用。从图6b可以看出，等高线的性状为圆形，表明了硼砂和壳聚糖交互作用不显著。

2.2.3 最佳复合防腐剂配方的确定及验证实验

根据二次回归的数学模型分析结果，得出在本试验条件下最佳抑菌配方为：硅酸钠质量浓度202 mg/L、硼砂质量浓度0.98 g/100 mL、壳聚糖质量浓度0.60 g/100 mL，此时百合鳞茎病斑直径为0.37 cm。为了验证响应面法的可行性，将最佳条件重复实验3次，百合鳞茎病斑直径为0.36 cm，与理论值相差不大，充分验证了模型的正确性，表明响应面法适用于百合鳞茎青霉病防腐剂配方的优化。

3 结 论

硅酸钠、硼砂和壳聚糖单独处理均能不同程度地抑制百合鳞茎青霉病的扩展，其中硅酸钠和壳聚糖的控制效果较好。依据响应面试验设计数学模型确定的最佳防腐剂复合配方为202 mg/L的硅酸钠＋0.98 g/100 mL的硼砂＋0.60 g/100 mL的壳聚糖，用此优化组合处理百合鳞茎，青霉病斑直径为对照组的51%，显著地抑制了青霉病的扩展。模型方差分析和响应面分析表明，该模型回归显著，对实验拟合较好，对控制百合鳞茎的青霉病有一定应用价值。

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Controlling Effects of Preservative Blends on Blue Mold of Lily Bulb

LI Jian-peng, HU Lin-gang, LI Yong-cai*, BI Yang, GE Yong-hong, WANG Yi
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

This study was designed to examine the inhibitory effect of mixtures of sodium silicate, sodium borate and chitosan on blue mold of Lanzhou lily bulbs (Lilium davidii var. unicolor). Based on single-factor experiments, a quadratic polynomial regression equation model was developed by using Box-Behnken design (BBD) and elucidated by response surface analysis. The results showed that all three preservatives when used individually reduced the expansion of blue mold effectively and their efficacy descended in the order: sodium silicate ＞ chitosan ＞ sodium borate. The most effective inhibitory activity against blue mold was obtained by mixing sodium silicate, sodium borate and chitosan at final concentrations of 202 mg/L, 0.98 g/100 mL and 0.60 g/100 mL. The resulting lesion diameter was only 51% as compared to the control, thereby significantly controlling the expansion of blue mold.

lily bulb; blue mold; preservatives; response surface methodology

TS255.3

A

1002-6630（2014）03-0071-05

10.7506/spkx1002-6630-201403015

2013-03-19

甘肃省应用技术研究与开发专项计划项目（1004TCYA039）；兰州市高新技术产业化项目（2011-1-34）

李渐鹏（1988—），男，硕士研究生，主要从事采后果蔬角质层组分及结构研究。E-mail：869746940@qq.com

*通信作者：李永才（1973—），男，副教授，博士，主要从事果蔬采后防腐保鲜技术研究。E-mail：liyongcai@gsau.edu.cn