红发夫酵母中3R,3’R-虾青素的分离纯化和结构鉴定

孙伟红，林 洪*，翟毓秀，冷凯良，邢丽红

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071)

红发夫酵母中3R,3’R-虾青素的分离纯化和结构鉴定

孙伟红1,2，林 洪1,*，翟毓秀2，冷凯良2，邢丽红2

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071)

研究红发夫酵母中3R,3’R-虾青素的分离纯化工艺条件，并利用高效液相色谱串联大气压化学电离源质谱（high performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization- mass spectrometry，HPLCAPCI-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和高效液相色谱-紫外光谱（high performance liquid chromatography-ultra violet，HPLC-UV）对纯化得到的虾青素结构进行鉴定。结果表明：利用细胞玻璃研磨器进行研磨提取、硅胶柱层析分离和结晶提纯相结合的方法，能够有效减少反式虾青素的异构化，得到的虾青素纯度高于95%。采用高效液相色谱-质谱仪（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）、超导核磁共振谱仪（1H和13C NMR）以及Chiralpak IC手性固定化纤维柱分析，显示制备的反式虾青素几乎都以3R,3’R结构组成。

红发夫酵母；3R,3’R-虾青素；分离；纯化；结构鉴定

虾青素（astaxanthin），分子式为C40H52O4，是动物界中分布最广泛的一种类胡萝卜素。虾青素具有极强的抗氧化性能，其还原能力是VE的几百倍以上，有“超级VE”之称。此外，它还具有很强的抑制肿瘤发生和生长、抑制多元不饱和脂肪酸的氧化、抵御紫外线的作用、替代VA活性、增强人体免疫功能、改善视力、色素形成和神经连通以及改善生育等的作用，同时还有清除二氧化氮、硫化物、二硫化物和降低脂质过氧化作用[1-4]。

红发夫酵母（Phaff a rhodozyma）被认为是除雨生红球藻外最为合适的虾青素来源[5]。红发夫酵母属于担子菌纲（Basidiomycetous）的红发夫酵母属，1976年Andrews等[6]发现其产生虾青素，红发夫酵母中虾青素的含量是甲壳类动物虾青素含量的5～50 倍，是雨生红球藻的1%～10%。但酵母内虾青素的积累也受发酵时各种环境因子的影响，会随发酵培养基的改变而改变，受温度、pH值、溶氧、碳氮源等的影响也比较大。如果在菌株选育等方面能有所突破，势必会带来大规模的商业化生产和应用潜力。

虾青素的化学结构是由4 个异戊二烯单位以共轭双键形式联结，两端又有2 个异戊二烯单位组成6 节环结构。因为含有一个长的共轭双键系统，其稳定性差。全反式虾青素在3和3’位置有2 个不对称碳原子，能以3 种构象（光学异构体）存在，包括一对对映体（3S,3’S；3R,3’R）和内消旋形式（3R,3’S）。不同生物来源虾青素的异构体的比例不同[7]，酵母中的虾青素98.5%以3R,3’R全反式结构存在[8]。

对于红发夫酵母的分离纯化，国内外已有一些研究，郭建瑞等[9]采用硅胶为吸附剂，石油醚-乙酸乙酯混合液为洗脱剂从粗色素油中分离纯化虾青素，但是该方法没有制备虾青素的晶体，对虾青素纯度的测定方法也不够准确；Lim等[10]研究了用超临界萃取方法从红法夫酵母提取虾青素的条件，酵母经破壁后分别用分子筛法和喷雾干燥法进行干燥，虾青素的产率为90%。但是，由于虾青素在提纯过程中容易受到光、热等的影响发生异构化，所以目前的提纯方法难以得到3R,3’R全反式结构的虾青素纯品。本研究通过改进破壁等提取方法，以及层析分离和纯化技术的优化，制备了3R,3’R结构的虾青素纯品，同时对其纯度和结构进行了鉴定，为深入研究3R,3’R结构虾青素的作用机制，以及应用于功能食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红发夫酵母粉（虾青素含量约为0.35%）购自青岛森淼实业有限公司；全反式虾青素标准品（纯度为（95.8±0.5）%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司。

硅胶（300～400目）、丙酮、正己烷、异丙醇、乙腈、甲醇、二氯甲烷和叔丁基甲基醚等均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1100液相色谱仪（配紫外检测器） 美国Agilent公司；AVANCEⅡ600MHz超导核磁共振谱仪 瑞士Bruker公司；TSQ Quantum Access液相色谱-高分辨串联四极杆质谱联用仪（配有大气压力化学电离源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）源） 美国Thermo公司；HL-S恒流泵 上海泸西分析仪器厂；玻璃层析柱（4cm×50cm） 上海楚定分析仪器有限公司；R-200旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司；Turbo VapⅡ型吹氮浓缩仪 美国Caliper公司；L-550台式离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；YMC-Carotenoid C30色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 日本YMC公司；实验用水为自制Milli-Q超纯水 美国Millipore公司。

加工误差指机床加工过程中刀具实际路径与设计理想位置之间的尺寸偏差。加工误差影响新加工出来的零件特征，用零件特征的局部坐标系相对于机床坐标系的偏差表示。

1.3 方法

1.3.1 虾青素测定

参照文献[11]中的方法，色谱柱为YMC-Carotenoid C30色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为叔丁基甲基醚，流动相C为1%体积的磷酸溶液；洗脱梯度为：81%A、15%B、4%C（0 min）；66%A、30%B、4%C（15 min）；16%A、80%B、4%C（23 min，保持至27 min）；81%A、15%B、4%C（30 min）。流速为1.0 mL/min；检测器为紫外检测器；检测波长为474 nm；进样量为20 μL；柱温：室温。

1.3.2 虾青素的提取

每次加入约500 mg酵母粉于细胞玻璃研磨器中，并加入少量丙酮充分研磨，将提取液超声提取5 min，5℃、10 000 r/min离心5 min，收集红色提取液。重复提取酵母渣3 次，合并提取液。采用此方法提取约5 g酵母粉，收集约400 mL提取液。经液相测定，提取液中游离虾青素全部为全反式结构。

1.3.3 虾青素的纯化

采用4 cm×50 cm层析柱，加入80 g硅胶（经120 ℃活化60 min，正己烷浸泡过夜后湿法装柱），高度为40 cm，正己烷平衡柱子，将提取液真空浓缩至约5mL后上柱，加入正己烷-二氯甲烷-丙酮（5∶2.5∶1，V/V）洗脱，流速为0.5 mL/min，弃掉开始流出的约1 000 mL馏分（脂类等杂质峰稍多），收集剩余的红色洗脱液，经液相测定，游离虾青素含量高于75%。

室温下将提取液真空浓缩至干，加入约100 mL丙酮溶解，转移到具塞三角瓶中，于氮气下吹扫，使达到过饱和状态，并有少量红棕色晶体生成，加入几滴蒸馏水，在4 ℃左右下低温析晶72 h，收集晶体后先后用蒸馏水和丙酮清洗两次，真空低温冻干。经测定，晶体纯度为95%。

1.3.4 虾青素的手性确证

参照Wang等[12]的方法稍作改进，正相系统，Chiralpak IC 手性色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为叔丁基甲醚-乙腈（50∶50，V/V），流速为1.0 mL/min；检测器为紫外检测器；检测波长为476 nm；进样量为20 μL；柱温：室温。

2 结果与分析

2.1 红发夫酵母提取方法的优化

红发夫酵母的细胞壁较厚，有效的破壁方法对虾青素的有效提取非常重要。常用的破壁方法包括微波法[13]、低温研磨萃取法、有机溶剂萃取法和低温研磨法[14]等，其中低温研磨法是比较常用的破壁方法。但是在操作中发现，研钵在低温研磨时可能会破裂，而且用溶剂转移时容易造成损失。最终，该方法采用了细胞玻璃研磨器进行有机溶剂研磨提取，方法方便、快速、高效，而且可以有效减少虾青素的异构化。

在常温下，虾青素在有机溶剂中的溶解度不同[15]，二氯甲烷>氯仿>乙腈>丙酮，但是反式结构的虾青素在有机溶剂中容易转化为顺式结构，异构化率的大小与溶剂有关，二氯甲烷>氯仿>甲醇>丙酮，而且温度的升高能够加快异构化的进程[16]。虽然二氯甲烷的溶解度最大，但是异构化率也最高，为了减少标准品制备中顺式结构的干扰，选择了丙酮作为提取溶剂。

图1 红发夫酵母提取物的色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of Phaff a rhodozyma extract

虾青素在红发夫酵母中主要以游离态存在，由图1可知，提取液中全反式虾青素含量较高，还有少量脂类等杂质存在，需要进行进一步纯化。

2.2 柱层析分离

分离虾青素与其他色素和酯类，可以利用酚羟基对阳性基团的吸附，实现虾青素与其他化合物的分离，然后通过解吸附来分离虾青素。当提取物中含有胡萝卜素和脂类等杂质时，通常采用硅胶作为固定相对色素进行净化[17]，而一定比例组成的极性和非极性混合溶剂适合作为洗脱溶剂。本研究对层析柱规格、硅胶的添加量、洗脱溶剂和馏分中虾青素的含量进行了确定。参考刘莉娜等[18]对法夫酵母中虾青素的提纯方法，在实验中选择了300～400 目的硅胶，对层析柱的规格（3 cm×30 cm、4 cm×50 cm、5.5 cm×60 cm）、硅胶用量（40、80、120 g）和洗脱溶剂（正己烷、正己烷-丙酮（7∶3，V/V）、正己烷-二氯甲烷-丙酮（5∶2.5∶1，V/V））进行了选择。3 cm×30 cm层析柱上样量小、分离效果差，而5 cm×60 cm层析柱洗脱时间太长，只有4 cm×50 cm层析柱的分离效果和洗脱时间均能满足要求。硅胶用量也与上样量、洗脱时间和分离效果有关，依据文中的上样量，经多次实验，硅胶填充量以80 g为宜。洗脱溶剂的选择要依据溶剂极性和它们的混溶性，以及溶剂对被分析物的溶解性，以及被分析物的结构，在实验中发现，正己烷-二氯甲烷-丙酮（5∶2.5∶1）的洗脱时间、分离度和样品得率均优于其他试剂。根据上述实验结果，最终确定层析柱规格为4 cm×50 cm，硅胶填充量为80 g，正己烷：二氯甲烷：丙酮（5∶2.5∶1，V/V）作为洗脱溶剂。在实验中分段收集最上层紫红色色带上洗脱下来的溶液，测定虾青素纯度和含量，只收集并浓缩纯度大于75%的洗脱液。

2.3 结晶提纯

溶液结晶常被用作固体材料的分离提纯过程。为了提高产率，增加晶体的纯度，需要优化结晶过程的各项参数。虾青素在有机溶剂中容易异构化，综合考虑其在不同溶剂中的异构化率和溶解度（在丙酮中溶解度为0.2 g/L）[15]，选择丙酮作为结晶溶剂。由于虾青素不溶于水相溶剂，加入少量水能够促进溶析结晶，所以该方法采用了水析结晶的方式，得到的晶体晶形好，不易包藏母液，最后采取少量水和丙酮清洗晶体表面，更有利于清除母液和杂质。考虑到虾青素不稳定的化学性质，整个结晶过程应保持充氮避光和低温环境下，太低的温度下晶体析出快，不利于纯化，而4 ℃左右的温度条件可以促使晶体较快析出，通过液相色谱仪测定，制备的晶体经低温冻干后得到的纯度大于95%。此外，结晶过程不能太长，72 h左右是比较理想的结晶时间能够保证得到较多的晶体，并能减少异构化的影响。

2.4 3R,3’R-虾青素的鉴定

将制备的化合物进行HPLC-MS测定，在正离子模式下采用APCI源对其主要结构信息和裂解规律进行分析，具有下列3 个主要特征峰：597（M+）、579（[M-18]+）、561（[M-36]+），m/z 579和561均是母体分子失去水所产生的碎片离子，这说明其分子质量和裂解规律与虾青素相同。

为了进一步证明化合物的构型，应用600 MHz1H NMR进行了光谱测定，全反式虾青素标准品和酵母提纯样品的1H NMR 和13C-NMR图见图2、3。经解谱，样品1H NMR和13C NMR的解谱结果与反式虾青素标准品完全一致，可以说明制备化合物为反式虾青素。

图2 全反式虾青素标准品的1H NMR（aa）和1313C-NMR（b）图Fig.2 1H NMR (a) and13C NMR (b) of all-trans-astaxanthin standard in CDCL3

图3 红发夫酵母中提取的虾青素的1H NMR（aa）和13C-NMR（b）图Fig.3 1H NMR (a) and13C NMR (b) of all-trans-astaxanthin from Phaff a rhodozyma in CDCL3

目前测定虾青素光学异构体比例的方法是基于相应的非对映体的分离，可以采用Chiralpak IC手性固定化纤维柱对全反式虾青素的3种光学异构体进行分离。图4是全反式虾青素光学异构体的色谱图，合成虾青素异构体的3R,3’R∶3R,3’S∶3S,3’S比例为1∶2∶1，红发夫酵母中提取的反式虾青素几乎都以3R,3’R结构组成。

图4 合成虾青素（a）和红发夫酵母中提纯的虾青素（b）的光学异构色谱图Fig.4 Chromatographic separation of all-trans-astaxanthin isomeric mixture from synthetic all-trans-astaxanthin (a) compared with that derived from Phaff a rhodozyma (b)

3 结 论

本研究以红发夫酵母为原料，利用硅胶柱层析和结晶提纯对虾青素进行了分离、纯化并对得到的虾青素进行了结构鉴定，结论如下：1）利用本方法可以制备纯度高于95%的虾青素标准品；2）样品1H NMR和13C NMR的解谱结果与反式虾青素标准品完全一致，可以说明制备化合物为反式虾青素；3）通过Chiralpak IC手性固定化纤维柱的分离，确定红发夫酵母中提取的反式虾青素几乎都以3R,3’R结构组成。

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Separation, Purification and Identification of (3R,3’R)-trans-Astaxanthin from Phaff a rhodozyma

SUN Wei-hong1,2, LIN Hong1,*, ZHAI Yu-xiu2, LENG Kai-liang2, XING Li-hong2
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Yellow Sea Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

The separation and purification of (3R,3’R)-trans-astaxanthin from Phaffia rhodozyma were studied, and the 3R,3’R isomers were characterized by HPLC-APCI-MS,1H and13C NMR and HPLC-UV. The results showed that the isomerization of trans-astaxanthin was effectively inhibited by combined use of glass tissue grinder for extraction, lowpressure silica gel column chromatography for separation and crystallization of supersaturated astaxanthin in acetone for purification, and the purity of all-trans-astaxanthin crystalline powder was verified to be above 95% by using HPLC. Then, HPLC-APCI-MS,1H and13C NMR and chiralpak IC column based on cellulose tris(3,5-dichlorophenyl carbamate) polymer confirmed that the trans-astaxanthin was composed almost exclusively of 3R,3’R isomer.

Phaff a rhodozyma; (3R,3’R)-trans-astaxanthin; separation; purification; identification

TS202.3

A

1002-6630（2014）11-0079-04

10.7506/spkx1002-6630-201411016

2013-07-10

孙伟红（1977—），女，助理研究员，博士研究生，研究方向为水产品安全性与质量控制。E-mail：sunwh@ysfri.ac.cn

*通信作者：林洪（1962—），男，教授，博士，研究方向为水产品安全性与质量控制。E-mail： linhong@ouc.edu.cn