复合诱变法选育谷氨酰胺转胺酶高产菌株

张 莹，郭琛琛，黑东燕，张 伟，鲁 伟，金明飞,*

（1.华东师范大学生命科学学院，上海 200241；2.泰兴市东圣食品科技有限公司，江苏 泰兴 225411）

复合诱变法选育谷氨酰胺转胺酶高产菌株

张 莹1，郭琛琛1，黑东燕1，张 伟1，鲁 伟2，金明飞1,*

（1.华东师范大学生命科学学院，上海 200241；2.泰兴市东圣食品科技有限公司，江苏 泰兴 225411）

为筛选谷氨酰胺转胺酶高产菌株，利用紫外-硫酸二乙酯复合诱变、一次筛选的方法诱变生产菌株茂源链霉菌（Streptoymyces mobaraensis），结合高通量筛选技术筛选高产菌株。结果表明：复合诱变的方式较单独诱变的方式效率高。经过诱变的高产菌株由于酶的成熟加快或者蛋白表达量增加而提高了酶活力，最高可达7.02 U/mL，比野生菌株提高了54%。进一步研究高产菌株发现，高产菌株谷氨酰胺转胺酶的成熟加快，可提前24 h结束发酵；发酵液中酶原含量高，会降低发酵液中酶活性。

谷氨酰胺转胺酶；茂源链霉菌；硫酸二乙酯；紫外；复合诱变

微生物谷氨酰胺转胺酶（EC. 2.3.2.13，microbial transglutaminase，MTG）作为一种蛋白的“超级黏合剂”[1]，在食品行业中有着广泛的应用[2-3]，2012年国内的销售总额近1亿元，已经成为最大的单一食品用酶制剂。尽管如此，生产菌株茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis）的MTG产量较低，产酶水平只有日本味之素公司的1/3～1/5左右，跟国际水平相比具有较大的提升空间[4-5]。作为食品用酶，对MTG的生产有着严格的规定，必须符合相关法律和GB2760—2011《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》等要求，要提高其产量目前最好的方法是传统的诱变育种技术[6]。紫外（ultraviolet，UV）诱变虽然诱变谱比较广泛，但较难获得某些氨基酸的突变，而且突变效率较低[7-8]；而硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）的诱变谱可与紫外诱变形成互补[9]。目前UV-DES复合诱变主要有两种方法：直接用UV、DES对菌悬液诱变后再涂布筛选[10]，对茂源链霉菌来说其缺点是致死率过高，难以得到理想的高产菌株；用UV（或DES）诱变后筛选高产菌株，再用DES（或UV）对高产菌株进行诱变、筛选[11]，这个方法一般耗时较长。本实验探讨了链霉菌孢子经UV（或DES）诱变后直接扩增培养，然后收集扩增后的孢子再进行DES（或UV）诱变、筛选，以提高诱变效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis，ATCC27441），本实验室保存。

1.1.2 培养基

高氏一号培养基（g/L）：NaCl 0.5、MgSO4•7H2O 0.5，KNO31、K2HPO4•3H2O 0.5、FeSO4•7H2O 0.01、可溶性淀粉20、琼脂20，pH 7.2～7.4。

种子培养基（g/L）：MgSO4•7H2O 2 、K2HPO4•3H2O 2、酵母膏5、甘油20、鱼粉蛋白胨25，pH 7.4。

发酵培养基（g/L）：MgSO4•7H2O 2、K2HPO4•3H2O 2、酵母膏6、甘油20、鱼粉蛋白胨25，pH 7.4。

1.1.3 试剂

还原型谷胱甘肽 中国医药上海化学试剂公司；N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸（Na-CBZ-Gln-Gly） 上海多肽公司合成；其他试剂均为分析纯试剂 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 技术路线

茂源链霉菌孢子培养→收集孢子→第1轮UV（或DES）诱变→扩增培养、收集孢子→第2轮DES（或UV）诱变→涂布、获取单菌落→高通量筛选→摇瓶复筛→突变菌株表达比较

1.2.2 诱变

以前期筛选到的稳定高产突变株作为出发菌株，在多次传代纯化的基础上选择其中1株开展本实验[12-13]。根据实验已经优化的条件进行紫外诱变[12-13]；DES诱变条件参考文献[14]进行，具体条件为：将孢子浓度为108个/mL的菌液700 μL用PBS稀释10 倍，实验组加入0.5% DES，用铝泊纸包裹避光，置于37 ℃摇床中反应55 min，取出立即2 500 r/min离心10 min，离心后弃上清，用无菌水重悬，稀释涂板。

第1轮用UV诱变，不经筛选扩增，所有突变菌株第2轮用DES诱变的实验组记为UV/DES组；同样地，第1轮用DES诱变，第2轮用UV诱变的实验组记为DES/UV组。两轮均未诱变的记为CK组，而第1轮用UV或DES诱变，第2轮未经处理的记为UV组或DES组。

1.2.3 筛选

根据本实验室优化的筛选方法进行[12-13]。即根据菌落形态，用96孔板高通量筛选的方法进行初步筛选，然后对候选的菌株利用摇瓶培养进行复筛。

正负突变率的计算：菌株发酵酶活力高于野生菌株酶活力的110%记为正突变，低于野生菌株发酵酶活力的90%记为负突变；其余则为等义突变。总突变率为正负突变率之和。

（正/负）突变率/%=（正/负）突变菌株数/总菌株数×100

1.2.4 酶活力测定

按照比色法测定发酵液中MTG酶活力[6]。

1.2.5 蛋白表达量检测

[15]的方法用SDS-PAGE检测发酵液中MTG的表达情况，上样量为总蛋白含量120μg。蛋白含量测定用美国Bio-Rad公司的ChemiDoc™ XRS成像仪自带扫描软件分析，通过灰度扫描和蛋白总量计算每个条带的蛋白含量。

1.3 数据分析

图像处理和数据分析用GraphPad Prism5软件处理。

2 结果与分析

2.1 复合诱变的筛选

图1 复合诱变的突变率Fig.1 Mutation rates induced by the combined mutagenesis

如图1所示，复合诱变与单纯的UV诱变或DES诱变相比，正突变率没有显著差异，但不论是DES/UV或者UV/DES的组合方式，负突变率及总的突变率均较单纯的诱变方式有显著提高。

图2 复合诱变初筛菌株的酶活力Fig.2 Enzymatic activities of screened mutants

如图2筛选结果所示，复合诱变的平均酶活力比对应的单一诱变或者野生菌株均有所下降，UV/DES组合诱变组与单纯用UV诱变或DES诱变组平均酶活力显著降低，这些结果与突变率一致（图1）。由于突变一般都是负突变较多，因此这也说明复合诱变的突变频率高于单一诱变，效果可能优于单一诱变。此外复合诱变组中有某些特别高产的菌株出现。此外这些结果提示DES的诱变效率可能高于UV。

2.2 突变菌株的复筛

将经过初步筛选后产量高于野生菌株酶活力110%的菌株作为候选菌株进行摇瓶复筛。如图3所示，除了1株只经DES诱变的菌株外，在发酵至72h时，各复合诱变菌株的酶活力均较野生菌株高。但是在发酵至48h时，UV、DES单独诱变及UV/DES复合诱变的菌株各有1株较野生菌株酶活力高，而DES/UV复合诱变菌株有3株的酶活力高于野生菌株。

图3 各突变菌株复筛酶活力Fig.3 Time course of TG activity in cultures with different secondround screened mutants

综合2.1节的结果， DES/UV的复合诱变方式优于DES或UV单独诱变的效果。而由于这种诱变方式只需要筛选一次，因此较传统的诱变-筛选-再诱变的方式效率高；结合高通量的筛选方法[12]，使得本诱变育种技术劳动强度大大下降，筛选量和成功率大大提高。

选取高产菌株，进一步的摇瓶发酵的发酵液中酶活力显示，酶活力最高的突变菌株DES/UV2（7.02 U/mL）比野生菌株（4.56 U/mL）产量提高了50%以上（数据未显示），而突变菌株在培养48h时最高酶活力已经可以达到5.83 U/mL，比野生菌株最高酶活力时高了近30%。从生产角度来说，该菌株不仅提高了产量，还大大缩短了产酶时间，可以大大节约成本。

2.3 高产菌株MTG表达

在获得高产菌株的基础上，对部分复筛效果较好的菌株利用SDS-PAGE技术进行分析，尝试对其高产机制进行初步研究。如图4所示，这些高产菌株的产酶活性提高并不是单纯的表达量增加所引起，最重要的还与成熟机制有关。

图4 不同发酵时间突变菌株MTG蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein expression with high-yield mutants at different time points of culture

24 h时突变株7（泳道7）发酵液中的总MTG表达量较野生菌株（泳道8）高，但酶活力为2.71 U/mL，比野生菌株的2.79 U/mL略低。发酵至48 h后这种成熟的差异更加明显，如突变菌株3的总MTG量比突变菌株4低，但其酶活力（5.8 U/mL）却比后者（3.18U/mL）高了近1倍。而48 h时酶活力较高的其他几个菌株：突变菌株1（5.83 U/mL）、突变菌株5（4.48 U/mL）及突变菌株7（5.16 U/mL）均是MTG成熟较早、MTG比例较高的菌株。

这些结果说明，突变菌株产量（发酵液酶活力）的提高可能与酶原（Pro-MTG）、成熟MTG量的相互比例有关。高产菌株的高产机制可能与MTG的成熟相关。

2.4 MTG高产差异比较

MTG在胞内被合成（pre-pro-TG）后，切除信号肽以酶原（pro-TG，本研究标识为Pro-MTG）的形式被分泌到胞外，在经过一系列蛋白酶的切割后，最终形成成熟的MTG[16]。由此可见，发酵液中MTG的酶活力不仅与MTG胞内合成——即总MTG质量（包括酶原、酶）有关，还受到成熟进程的影响。

在对高产机制有了初步认识的基础上，为了进一步研究酶原与酶之间的相关关系，本研究对部分经复合诱变获得的高产菌株进行了进一步的分析。几株高产菌株的发酵液上清经电泳后利用ChemiDoc™ XRS+成像仪扫描分析酶原（Pro-MTG）和成熟酶（MTG）的蛋白质量和相对含量，结果如表1所示。

表1 高产菌株发酵液上清中酶原、酶的蛋白质量和百分比Table1 Protein amounts and proportions of pro-MTG and MTG in cultures of high yield mutants

由表1可知，高产菌株之间的产酶时间存在较大差异，MU2虽然72h时酶活力最高，但是48h时产酶活性甚至低于野生菌株。MU4菌株虽然与野生菌株相比最高酶活力差异较小，但48h时的酶活力比野生菌株高了近50%。

进一步分析可以发现，发酵液中MTG的酶活力不仅跟MTG表达量有关，还受Pro-MTG蛋白量的抑制，最明显的是48h时，MU2中MTG的含量与MU1相似，但其酶活力却只有MU1的60%左右；而MU4发酵液中MTG的含量虽然只有野生菌株的90%左右，酶活力却比野生菌株高41.5%。

线性回归分析（99%可信度）发现，酶活力与Pro-MTG蛋白量、MTG蛋白量、Pro-MTG比例和MTG比例的相关系数分别为－0.7607（P=0.0010）、0.9286（P ≤0.0001）、－0.5929（P=0.0198）和0.7393（P= 0.0016），均有较高的相关性，且酶活力与MTG含量正相关、与Pro-MTG含量负相关，这也进一步证明发酵液中MTG活性确实会受到酶原的抑制。

这些结果说明部分突变菌株产量提高是由于成熟方式发生了改变，加快MTG的成熟可以提高发酵液中MTG的酶活力。

3 3 讨 论

连续对孢子进行UV、DES诱变的策略由于每种单个突变本身频率低，使得有利突变组合概率极低；先DES（或UV）诱变后筛选高产菌株，再对高产菌株进行UV（或DES）的方法，易把那种某个单独突变不能明显提高产量而与其他突变组合能显著提高产量的突变遗漏。而本实验用UV（或DES）对链霉菌孢子悬液进行诱变，将诱变后的悬液涂布扩增孢子后不经筛选直接用DES（或UV）进行诱变，将二次诱变后的悬液稀释涂布、挑单菌落筛选这样的育种工艺虽然较直接将孢子悬液连续用DES及UV诱变后涂布筛选的方法繁琐，但是却可以对某种诱变方式诱变后获得的有利突变（不一定明显提高产量）通过菌株扩大培养而得到保留，从而为二次诱变时提供更多的突变组合，提高了获得必须拥有UV及DES诱变才能提高产量的菌株。

一般紫外诱变的特点是突变谱比较广，但是效率比较低，不易获得理想的突变株[14,17-18]；而化学诱变剂的突变谱相对较窄，一般情况下不能获得AT→CG突变[9,19]。通过本研究的复合诱变方式可以有效地将两种突变的优势结合。同时研究也证实，化学诱变的效果较紫外诱变好[20]，而复合诱变的效果比单种诱变效果理想。

通过复合诱变的方式，可顺利筛选到了若干高产菌株，通过摇瓶发酵复筛验证发现，突变菌株最高酶活力比野生菌株提高了50%以上；突变菌株不仅产量有所提高，其产酶时间也明显提前。该菌株在缩短1/3生产时间的情况下仍可以比野生菌株在正常发酵时间下的酶活力提高近20%的产量。

在获得高产菌株的基础上，本实验探讨了突变菌株的高产机制。通过SDS-PAGE和灰度扫描的方法，首次证明发酵液中MTG的酶活力不仅仅与MTG自身的含量有关，还有酶原的含量成反比。发酵液中酶原含量的升高会直接导致总酶活力的下降，这可能酶原是成熟MTG的竞争性抑制剂的原因[21]。这些结果提示要获得MTG高产菌株，一个重要的手段是提高酶原的转化率和成熟速度[22]。在生产上，除了尽可能促使酶原转变为成熟的MTG[23]，还要尽可能在纯化工艺中去除酶原，以解除其对MTG的抑制作用。在今后的研究中，可进一步探索酶原对MTG抑制的原理，研究这种抑制的具体机理，以更好地促进MTG成熟、提高MTG的生产效率、降低MTG的生产成本。

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Screening and Characterization of High-Yield Microbial Transglutaminase-Producing Mutants Induced by a Novel Method

ZHANG Ying1, GUO Chen-chen1, HEI Dong-yan1, ZHANG Wei1, LU Wei2, JIN Ming-fei1,*
(1.School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China；2. Taixing Dongsheng Food Science and Technology Co. Ltd., Taixing 225411, China)

Microbial transglutaminase (MTG)-producing strain Streptoymyces mobaraensis (S. mobaraensis) was subjected to mutagenesis using UV irradiation and diethyl sulfate (DES) treatment and the resulting colonies were screened by a high throughput method. Results showed that the combined mutagenesis had better performance than single mutagenesis. The high-yield MTG-producing mutants had either a higher MTG protein expression or a shortened maturation time of MTG. Among these, one mutant had the highest yield of 7.02 U/mL enzymatic activity, which was 54% higher than that of the wild-type strain. Further study found that this strain expressed MTG products 24 hours earlier than the wild-type one did. However, the yield of MTG could be highly inhibited by the zymogen pro-MTG.

microbial transglutaminase (MTG); Streptomyces mobaraensis; diethyl sulfate (DES); ultraviolet (UV); combined mutation

Q939.97

A

1002-6630（2014）11-0139-04

10.7506/spkx1002-6630-201411028

2013-07-12

中央高校基本科研业务费专项资金项目（78210203）；华东师范大学青年教师队伍建设科研启动费（79633430）

张莹（1992—），女，本科，研究方向为食品微生物。E-mail：510139229@qq.com

*通信作者：金明飞（1979—），男，助理研究员，博士，研究方向为食品微生物。E-mail：mfjin@bio.ecnu.edu.cn