鹅细小病毒PCR－DHPLC检测方法的建立

饶桂波，邵洪泽，胡桂学＊，吴健敏

（1.广西兽医研究所，广西南宁530001；2.吉林省兽医科学研究所，吉林长春130062；3.吉林农业大学，吉林长春130118）

目前诊断鹅细小病毒（GPV）的主要方法有琼脂扩散试验、免疫荧光抗体试验、黄牛精子抑制试验、ELISA 和PCR 等［1－4］。近年来将变性高效液相色谱法（DHPLC）与PCR 方法结合用于微生物的检测，使PCR 方法的敏感度提高了100倍，大大提高了样品的检出率［5－6］。为了解决鹅群中因GPV 排毒量低而难以检出的问题，本研究拟建立一种敏感性更高的GPV PCR－DHPLC 检测方法，用于鹅群中GPV 的检测，为临床GPV 感染的检测，提供一种特异、敏感、快速、高通量的检测手段。

1 材料与方法

1.1 毒株

GPV JLDA 株，由吉林省畜牧兽医科学研究院赠送；GPV JLTP株，由本实验室分离保存。

1.2 试剂

Taq DNA Polymerase、dNTPs、100 bp DNA Ladder、T4DNA 连接试剂盒、pMD18－T 载体等，购自宝生物工程有限公司（大连）。

1.3 引物设计

根据GenBank中VP3 的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物，序列如下：P1：5＇－ATA AGCGCC TTTCACAGC－3＇，P2：5＇－AACGCAGGATCAGACGAA－3＇，由宝生物工程有限公司（大连）合成。

1.4 PCR 体系建立

采用50μL 反应体系，在0.5 mL 反应管中依次加Buffer 5μL、2.5mmol／L dNTPs 2μL、灭菌二馏水35μL、2U／μL Taq酶1μL、20pmol／μL上游引物、下游引物各1μL、模板5μL。混匀后稍离心，通过梯度PCR 确定反应条件。

1.5 DHPLC条件选择

根据变性高效液相色谱仪Aglient 1100 色谱柱：PS.DVB＆C18DNASep色谱柱（4.6mm ×50 mm，粒度3mm）。利用仪器软件，根据目的基因序列的大小，碱基比率等预测柱温。在柱温确定后，摸索流动液体配比及流速，确定最佳条件。

1.6 PCR－DHPLC特异性分析

提取鹅副粘病毒、鸭瘟病毒及正常番鸭胚尿囊液的核酸进行PCR，按照1.4 的体系条件对PCR产物，进行PCR－DHPLC检测，鉴定其特异性。

1.7 PCR－DHPLC敏感性分析

将GPV JLTP株病毒接种番鸭胚，提取尿囊液中的病毒核酸作为模板，利用上述引物扩增目的片段，扩增产物连接到pMD18－T 载体上克隆。……