我国结核病病理学诊断和研究的现状与展望

张海青 车南颖

病理学研究是医学研究的起源，也是联系临床与科研的桥梁。结核病(tuberculosis)病理学研究早在19世纪初就有报道。著名病理解剖学家、胸科医学的奠基者、听诊器的发明者René Théophile Hyacinthe La⊇nnec通过临床观察及病理解剖学研究，对结核病的发病原因、发展过程、诊断方法等方面进行了系统性阐述，并发表了影响整个医学界的多篇论著[1-3]。之后在1882年，R. Koch发现了结核病的病原体结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)，并进一步支持了La⊇nnec等的观点[4-6]。从1880年至1950年，结核病病理学研究非常活跃，通过观察研究不同类型的结核病病理改变提出了很多结核病发病机制及诊断相关的观点[7-10]。但在1950年前后抗结核药物陆续出现之后，结核病的治疗方式转化为抗结核药物疗法[11]，外科手术及介入性治疗逐渐减少，能获取的人体组织标本随之减少，结核病病理学研究也逐渐冷淡[12]。随着微生物学的发展，结核病的诊断中细菌学检测应用得更为广泛。抗结核药物出现后的几十年里，很多人认为利用抗生素能消除结核病，因此结核病研究出现了降温。但是20世纪末，结核病卷土重来，再次成为威胁全世界人类健康的首要传染性疾病，耐多药结核病甚至广泛耐药结核病的出现让人们意识到结核病不能单单依靠抗结核药物来控制或消除[13-15]。但现状是没有长期有效的抗结核疫苗，缺乏治疗耐药结核病的抗结核新药，而这些问题需要我们进一步深入了解结核病发病机制和人体对抗结核病的免疫应答机制才能找到有效的解决途径[16-17]。此外，结核病的早期快速诊断，特别是对菌阴肺结核及肺外结核病的诊断目前没有很好的办法[18-19]。这几方面，我们都可以从人体组织病理学中寻找答案。了解病灶发生、发展和消除的原因及机制，我们就有可能找到解决问题的金钥匙。因此，笔者将在结核病病理学诊断现状、分子病理学诊断新技术应用展望及结核病分子病理学研究进展等3个方面进行阐述。

结核病病理学诊断现状

病理学诊断是结核病确诊的重要手段，传统病理学诊断是通过大体和镜下观察病灶组织的病理形态学改变来获得诊断结果，具有针对性强、准确性高等优势。结核病具有特殊的病理学形态特点，如肉芽肿结构，包括类上皮细胞、朗罕(Langhans)细胞以及干酪样坏死等，可与大多数其他感染性疾病及慢性炎症进行鉴别诊断[20]。此外在标本中找到抗酸杆菌也是结核病病理学诊断的重要依据[20]。

目前结核病的病原体检查主要依靠痰标本的细菌学检查，但存在敏感度低，培养时间过长等缺点。由于菌阴肺结核与其他肺部疾病有时临床症状及影像学变化有相似之处，会出现误诊，因此病理学诊断在此类疾病的确诊中发挥着非常重要的作用[21-22]。另外，肺外结核病患者中临床症状及表现差异很大，很多情况下不出现典型的症状，容易被漏诊和误诊。王纾宜等[23]报道头颈部黏膜结核病患者经常不具有典型临床表现特征、无肺部或其他部位的结核病史，仅靠细菌学或影像学手段很难确诊，可以通过病理形态学及抗酸染色检查提高结核病诊断准确性。此外，在临床诊疗中淋巴结结核与恶性淋巴瘤、乳腺结核与乳腺癌、盆腔结核与卵巢癌、食管结核与食管肿瘤，以及甲状腺结核与甲状腺肿瘤等疾病之间会出现很难鉴别诊断的情况，可疑的情况下有必要进行组织病理学诊断以获得准确结论[24-28]。

虽然病理学诊断可以为结核病的确诊提供有效准确的依据，但由于结核病主要类型为肺结核，且肺结核的治疗主要依靠化疗手段，手术及介入性治疗只是在少数情况下才进行，所以获得病灶组织标本的途径有限。这是限制病理学诊断应用范围的主要原因。但随着近年来穿刺技术的迅速发展，如CT引导下的经皮肺穿刺活检术、超声引导下的针吸活检术等具有微创、精准、便利、低风险等特点，为菌阴肺结核和肺外器官结核病的病理学诊断提供了更多的组织标本。常占平[29]利用CT引导下的经皮肺穿刺活检术(computed tomography-guided transthoracic biopsy)对30例可疑肺结核进行诊断，其中29例可通过组织病理学获得确诊，而细菌学阳性率只有6.7%。顾晔等[30]利用气管内超声引导下针吸活检术(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration，EBUS-TBNA)获得了肺门纵膈肿物活检标本，通过病理学诊断可以确诊85.5%的结核病患者。Sun等[31]探索了EBUS-TBNA在肺结核诊断中的应用价值，发现病理学诊断可以确诊80%的结核病患者，而细菌学培养只有46%的阳性检出率。

近年来，随着基因检测技术的发展，分子生物学检测技术也逐渐应用于病理学诊断中。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是通过特异扩增目标基因片段而获得结果，具有敏感度高、可鉴别诊断结核病与非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)病等优势。罗春英等[32]报道，在可疑的结核病组织标本中real-time PCR方法阳性检出率为30.5%，显著高于抗酸染色的阳性率14.4%(P<0.05)。王旭洲等[33]比较了real-time PCR与传统抗酸染色及金胺O染色方法在组织标本中的结核病阳性检出率，发现PCR方法的阳性率为51.5%，显著高于抗酸染色和金胺O染色的阳性率(31.0%和40.5%)(P<0.05)，且可以鉴别出NTM。

总之，目前我国结核病病理诊断处于组织学和细胞学水平。病理诊断仍以结核病组织形态特征和查找病原体作为主要诊断依据。部分单位开展了一些结核病分子病理学的科研工作。由于PCR临床检测工作对实验室、仪器设备及技术人员的要求比较高，目前国内只有少数大型医院病理科开展了结核病的PCR检测工作。

分子病理学检测技术在结核病诊断中的应用展望

基于组织形态学及细菌学的传统病理学诊断虽然是结核病确诊的重要手段，但依然存在敏感度低及与其他疾病难于鉴别诊断等缺点。近年来，交叉学科融合的理念受到各界重视，分子生物学与病理学的交叉融合产生了一门新的分支学科分子病理学，将病理学的研究与诊断引领到蛋白质、核酸等生物大分子水平。

免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)是在病理组织标本切片中检测是否有目的蛋白的表达，在诊断肿瘤疾病及确定肿瘤分型中使用非常广泛，但是在结核病病理学诊断中的应用较少。相比其他常见的免疫学检测方法[如酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western blotting等]，IHC对于抗体的要求更高。近年来，研究发现利用识别分枝杆菌抗原的抗体用于IHC检查，可以提高结核病病理学诊断的敏感度。Ihama等[34]用抗结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MtbC)相对分子质量为38 000的抗原的单克隆抗体进行了肠结核的IHC检测。结果显示，相对分子质量为38 000的抗原主要分布在肉芽肿结构中的CD68+巨噬细胞内，染色呈颗粒状分布。我院病理科也研制了针对分枝杆菌主要分泌蛋白Ag85B的多克隆抗体，并在结核病病理标本中探索了该分泌蛋白的表达特点及病理学诊断价值。对105例结核病及51例其他疾病石蜡包埋组织标本进行的抗酸染色及IHC检测结果显示，抗酸染色法的敏感度为31.4%，特异度为100%；IHC的敏感度为50.5%，特异度为100.0%。IHC与抗酸染色法相比显著提高了阳性检出率(χ2=7.877，P=0.005)，在肺结核中提高了14.8%(χ2=2.424，P=0.12)，在淋巴结核中提高了23.5%(χ2=5.923，P=0.015)(待发表)。

在核酸检测方面，多种PCR新技术相继问世，为结核病的分子病理学诊断提供了更多选择。这些新技术可以进一步提高诊断敏感度，同时能快速鉴别诊断结核病与非结核分枝杆菌病，还能进行分枝杆菌菌型鉴定与耐药基因突变检测。Costa等[35]报道半巢式real-time PCR在结核病组织标本中的阳性检出率为98.2%，与普通real-time PCR阳性率40%相比有大幅度的提高。Kukanich等[36]报道利用PCR及基因测序方法在狗和猫的组织标本中成功鉴定出鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)。Chen等[37]报道了一种巢式PCR联合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)分析来进行快速菌种鉴定的新方法。通过检测16S rRNA、IS6110及IS1081基因序列，成功鉴定出MtbC及NTM。该方法可以检测出全部细菌学培养阳性临床标本及35.2%细菌学培养阴性标本中的分枝杆菌DNA，而且能在1 h内给出结果，具有快速灵敏的优点。Munkhdelger等[38]则报道利用膜反向杂交技术在石蜡包埋组织中成功鉴定多种NTM。该技术阳性率可以达到95%，与PCR及测序等方法相比具有分辨率高，快速便捷等优势。他们还检测了组织标本中Mtb菌株的利福平及异烟肼耐药相关基因的突变情况，发现110例结核病中有1例出现利福平耐药。

近年来，在痰标本、体液标本等临床标本中的分子生物学检测技术发展非常迅速，在临床诊断中的应用非常广泛；但在组织标本中的分子生物学检测技术推广比较慢，目前可用于临床诊断的具有我国FDA认证的诊断试剂盒非常少。因此，还需要开展更多适合病理学诊断的新技术、新方法的研究，同时需要加快这些新技术的临床验证工作，促进其在结核病分子病理学中的临床应用。今后，结核病病理诊断应在病理形态的基础上，在寻找病原体、菌型鉴定及相关耐药基因的检测方面做更多努力，为结核病的正确诊断与合理化治疗提供更准确的依据。

分子病理学在结核病基础研究中的作用

病理解剖学是人类认识结核病的开始，结核病的诊断及治疗理论起初都是由病理学家通过尸检或对手术标本的病理学研究所建立的。通过直接观察和分析病灶组织的病理学变化，我们可以对结核病的发病原因、发展模式、传播途径及治疗效果等进行直接研究。到现在，结核病动物模型的体内实验、最后评估依据都离不开病理解剖学的分析结果。但传统病理学的大体及显微镜观察等研究手段只能获得组织及细胞层面的信息。随着分子生物学与病理学的相互交叉渗透，20世纪70年代利用分子生物学技术研究疾病病因、发病机制、形态变化及功能损伤规律的新的分支学科分子病理学诞生。分子病理学研究主要集中在蛋白质、核酸等生物大分子水平，这为结核病病理学研究注入了新的生机。

1.在结核病发病机制研究中的作用：目前用于研究结核病的动物模型很多，人们通过研究这些动物模型中Mtb感染、扩散及消除，对结核病有了更加深入的了解。利用小鼠、猕猴等模型，Flynn研究团队[39-41]深入研究了TNF-α在结核性肉芽肿形成与解体中的作用，发现TNF-α是肉芽肿形成所必须的细胞因子，如果TNF-α缺失肉芽肿形成会被延迟，且结构出现紊乱。这也是长期用抗TNF-α免疫治疗的人群容易出现结核病复发的原因。此外，Davis等[42]利用斑马鱼模型研究了海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)感染斑马鱼后肉芽肿型病灶形成及播散变化，提出肉芽肿虽然是控制结核病的重要免疫病理反应，但在感染初期有可能起到促进结核病灶播散的作用。但也有研究人员提出，动物模型中研究结核病不能真实反映人体内发生的病理变化，因为不同种属动物的结核病病理病变类型差异很大，如小鼠感染结核分枝杆菌后肺部很少会出现坏死性病变，但坏死性病变是人肺结核的基本病变类型。另外，在动物模型中重现继发性肺结核比较困难，大部分动物模型研究都是采用初次感染，但人结核病大部分都是继发性的[12,43]。

2.在结核病流行病学研究中的作用：结核病是一种古老的疾病，在古埃及木乃伊，中国古代墓葬中出土的干尸中都报道找到结核病病灶。由于微生物学是近代出现的学科，古代没有菌种分离及保存技术，所以研究古代结核病流行病学，检测组织标本是惟一可行的选择。Lalremruata等[44]报道利用PCR方法获得了古代埃及曾经流行结核病的证据。他们收集了古埃及金字塔中出土的16具木乃伊的软组织标本，提取DNA后进行了PCR检测，发现其中5具木乃伊组织标本中Mtb IS6110基因阳性。这一结果表明，当时该地区曾经流行过结核病。此外，福尔马林固定的石蜡包埋组织在室温中可以稳定存在几十年，与苛刻的菌种保存相比更加安全和便捷，因此检测组织标本中Mtb的基因信息可以为结核病流行病学研究带来新的途径。

病理学在人类认识结核病中起到了非常重要的作用，不仅开启了结核病科学研究的大门，也为结核病临床诊断和治疗奠定了基础。病理学研究对象主要是发病部位的组织及细胞，在疾病病因、发展及功能代谢机制研究中有着直接、真实等诸多优势。随着分子病理学的出现，结核病病理学研究又出现了新的生机。未来，分子病理学在结核病诊断及发病机制研究中将发挥更加重要的作用。

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