小鼠主动脉狭窄后不同时期心室肌细胞后除极和触发活动的变化*

焦 宏，张 勇，王晓玲

（1.河北北方学院基础医学院，2.河北北方学院附属第一医院，河北张家口075000）

主动脉狭窄、高血压、瓣膜性心脏病等压力超负荷状态下，心肌组织学肥厚性重构，心肌细胞电生理特征的一个重要改变是动作电位时程（action potential duration，APD）延长，APD延长可因早后除极（early after depolarization，EAD）、迟后除极（delayed after depolarization，DAD）产生触发活动和／或复极化的不同步产生兴奋折返而导致各种类型心律失常，成为心力衰竭最重要的原因。

本实验利用玻璃微电极技术，记录主动脉狭窄诱发的心肌肥厚动物模型小鼠左心室乳头肌AP、EAD、DAD和触发活动情况，以及通过检测低钾或异丙肾上腺素灌流后所诱发后除极触发活动的情况，探讨主动脉狭窄发展过程中小鼠心律失常可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制备［1］

雄性昆明种小鼠96只（20±2 g，河北医科大学实验动物中心提供，II级），随机选60只为模型组（model group），36只对照组（control group），腹腔注射125 mg／kg氯胺酮麻醉。于胸骨左侧缘沿第二肋间隙作一3 cm横切口，钝性分离肌肉，打开胸腔，暴露主动脉弓，左颈总动脉（第一分支）和左锁骨下动脉（第二分支）间穿线备用，平行放置27-gauge（直径0.4 mm）针头，主动脉弓及垫针一并进行结扎，抽出针头后使主动脉狭窄65%～70%，即主动脉狭窄动物（模型组）。对照组手术同上，但不结扎主动脉弓。随机选用术后2周、5周、9周和13周动物各8只进行心脏乳头肌细胞内电位记录。

1.2 玻璃微电极技术测定乳头肌的动作电位后除极、触发活动

小鼠腹腔注射125 mg／kg氯胺酮麻醉后，迅速打开胸腔，取出心脏，浸于混合气（95%O2，5%CO2）饱和的冷Krebs-Henseleit（K-H）液，分离乳头肌。将乳头肌用不锈刚针固定在玻璃浴槽底部的硅胶上。混合气饱和的 K-H液（36.0±0.5）℃恒速灌流，流速为 4 ml／min。稳定 1 h后，给予刺激：波宽 1 ms，频率1 Hz，电压强度为阈刺激的1.5倍。微电极推进器将尖端电阻10～30 MΩ的玻璃电极（内充3 mol／L KCl）缓慢推进乳头肌细胞内，记录细胞内动作电位（AP）及自发的后除极（包括EAD和DAD）和触发活动。选用状态良好的乳头肌细胞，低钾（1 mmol／L KCl）或者含有异丙肾上腺素（20 nmol／L）溶液分别灌流后记录诱发EAD，DAD以及触发活动情况。

1.3 溶液组成

K-H液 （mmol／L）：118 NaCl，25 NaHCO3，4.7 KCl，1.6 MgSO4，2.5 CaCl2，1.2 KH2PO4和 10 glucose（pH 7.4）。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 主动脉狭窄发展过程中小鼠乳头肌细胞动作电位APD90的变化

与control组比较，小鼠乳头肌动作电位APD90在model组2周和5周未见明显改变，而model组9周（79.2±0.9 ms vs 61.4±0.5 ms）和 13周（108.5±0.7 ms vs 63.2±0.4 ms）出现明显延长（图 1）。

2.2 主动脉狭窄发展过程中小鼠乳头肌自发性EAD和DAD的变化

图2示model组13周小鼠乳头肌自发性EAD和DAD原始图。在记录的30 min时间内，model组9周和13周动物出现 EAD（发生率分别为：20.2%，34.3%）和 DAD（发生率分别为：15.3%，38.1%），而control组以及model组2周和5周动物未出现EAD和 DAD（图 3）。

Fig.1 Summary data for APD at 90%repolarization（APD90）in control and model mice at 2，5，9 and 13 weeks APD：Action potential duration

Fig.2 Spontaneous EADs（a）and DADs（b）in model mice at 13 week

Fig.3 Summary data for incidence of spontaneous EADs and DADs in model mice at 2，5，9 and 13 weeks EAD：Early after depolarization；DAD：Delayed after depolarization

2.3 主动脉狭窄发展过程中小鼠乳头肌低钾或异丙肾上腺素触发EAD和DAD的改变

与control组比较，model组异丙肾上腺素或低钾诱发EAD和DAD的发生率（异丙肾上腺素：16.2%，36.2%，49.1%和 65.8%；低钾：35.6%，54.8%，70.12%和 89.5%），显著增高，并且 model组动物的发生率随着时间进行性增加（图4、图5）。

Fig.4 Incidence of EADs and DADs induced by 20 nmol／L isoproterenol（Isop）in control and model mice at 2，5，9 and 13 weeks

Fig.5 Incidence of EADs and DADs induced by 1 mmol／L KCl in control and model mice at 2，5，9 and 13 weeks

3 讨论

心律失常发生的原因包括冲动产生异常和冲动传导异常。后除极（after depolarization）指在心肌细胞动作电位继0相除极后所发生的除极，其振幅较小，频率较快，膜电位不稳定［2］。后除极诱发的触发活动是异常冲动产生的重要原因。一旦这种振荡性除极引起可扩布的动作电位，则产生异常冲动的发放，即触发活动（triggered activity，TA）。根据后除极发生的时间不同，分为EAD和DAD［3］。

EAD，DAD产生的触发活动与L-型钙通道开放和钙超载相关，EAD具有慢频率依赖性，APD延长将增加EAD的发生率。EAD产生的触发活动可易化期外收缩并加剧复极离散度（TDR），从而易于发展为折返性心律失常。近年来的研究认为，EAD是尖端扭转型（torsades de pointes，TdP）室性心动过速的始动因素，折返使 TdP得以维持［4，5］。早后除极活动参与了许多先天性长 QT综合征（如 LQT2，LQT3，LQT6）或获得性长 QT综合征（心肌肥厚，心衰，减少IKr电流药物）相关的多样性室性心动过速的形成［6］。DAD具有快频率依赖性，DAD诱发导致的触发活动通常是心动过速型心律失常的基础。后除极触发活动常常被缺氧、缺血、心肌梗死、洋地黄类药物、β-肾上腺素受体激动剂、高频刺激、细胞外高钙和低钾等所诱发，触发活动已被公认为心律失常的重要机制之一。

本实验利用传统的玻璃微电极技术，观察了主动脉狭窄后左心室乳头肌动作电位APD、EAD、DAD和触发活动情况，发现后除极和触发活动的产生因病理阶段的不同而不同。主动脉狭窄后心肌肥厚阶段乳头肌的APD90没有改变，同时也没有看到自发性EAD或DAD；主动脉狭窄后心衰阶段乳头肌的APD90明显延长，伴有大量自发性 EAD、DAD以及触发活动；体外灌流低钾或者异丙肾上腺素后，可以诱发出大量的EAD、DAD以及触发活动，主动脉狭窄后心衰阶段的发生率明显高于心肌肥厚阶段。异丙肾上腺素作为β-肾上腺素受体激动剂，通过激活腺苷酸环化酶，提高细胞内cAMP水平，继而激活cAMP依赖性蛋白激酶，钙通道或相关蛋白磷酸化而增加 Ca2＋电流［7，8］。Ca2＋内流增加，可延长心肌细胞复极时间，从而引起EAD。细胞内Ca2＋超载进而导致肌浆网自发性Ca2＋释放增多，引起DAD。心肌肥厚、心衰时，细胞内的钙代谢异常，尤其是心衰时肌浆网的Ca2＋-ATP酶及RyR功能异常，导致舒张期钙超负荷和收缩期钙离子释放不足（收缩下降），推测此时心室肌细胞 IKr，IKs，IK1，ICa-L，INaL等多种通道的异常导致产生 EAD、DAD以及触发活动［9，10］。

主动脉狭窄心肌肥厚早期阶段没有记录到自发性EAD可能是此时乳头肌的APD90没有明显延长的结果，自发性DAD的缺失，推测此时细胞内没有明显Ca2＋超载现象。但是与同期的假手术组相比，主动脉狭窄后心衰阶段低钾或者异丙肾上腺素明显诱发出大量EAD、DAD以及触发活动，说明主动脉狭窄后心肌肥厚阶段仍然处于电生理的不稳定期，该阶段心律失常的发生可能存在其他机制［11，12］。

在实验过程中，我们发现，3相EAD很多，2相EAD极少，是否因为小鼠的心率很快，APD短，没有明显平台期，所以EAD主要表现为3相EAD。希望以后在大动物心肌肥厚导致的心衰模型上继续探讨2相EAD和3相EAD在心律失常发生中的不同作用。可能的解释是，主动脉狭窄后心肌由肥厚到心衰的病理进展中，心肌细胞EAD，DAD以及触发活动逐渐增多，心肌细胞的电不稳定性逐渐增加。

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