乳酸菌细菌素的高效表达方法研究

章检明，任璐雅，易华西*，张兰威

（哈尔滨工业大学食品科学与工程学院中法乳联合实验室，黑龙江哈尔滨150090）

乳酸菌细菌素的高效表达方法研究

章检明，任璐雅，易华西*，张兰威

（哈尔滨工业大学食品科学与工程学院中法乳联合实验室，黑龙江哈尔滨150090）

乳酸菌细菌素作为天然的生物防腐剂，因其高效、无毒等特点而备受关注，但目前只有乳酸链球菌素实现了工业化生产。乳酸菌细菌素产量低是限制其大规模生产的瓶颈之一。从高产菌株筛选、发酵条件调控、基因工程技术、诱导调控和胁迫刺激应答5个方面，综述了提高乳酸菌细菌素产量的方法，期望为提高乳酸菌细菌素产量的研究提供新思路。

乳酸菌；乳酸菌细菌素；方法；产量

乳酸菌细菌素是由乳酸菌在代谢过程中由核糖体产生的一类小分子质量、安全无毒，并且具有抗菌活性的蛋白质或多肽。目前，以nisin为代表的乳酸菌细菌素作为天然的食品防腐剂已广泛的应用于乳制品、肉制品等食品工业中，以延长产品的货架期[1-2]。根据乳酸菌细菌素的分子质量大小、抗菌谱、稳定性等性质的不同，可将其分为4类。第1类（classⅠ）为含羊毛硫氨基酸的细菌素，它是一种具有热稳定性，有较广的抑制谱、包含羊毛硫氨基酸、不饱和氨基酸等，分子质量＜5 ku的多肽，nisin就属于这一类。第2类（classⅡ）为不含羊毛硫氨基酸的细菌素，其是一种具有热稳定性的，分子质量＜10 ku的活性多肽，以片球菌素（pediocin）为代表。第3类（classⅢ）为热敏感性的，分子质量＞30 ku的大分子蛋白。第4类（classⅣ）为复合型细菌素，其抗菌活性通常需要与蛋白质、脂质或碳水化合物共同作用[3-4]。对于乳酸菌细菌素的一些特性，包括酸碱耐受性、热敏感性、抑菌谱、蛋白酶敏感性等，不同类型的细菌素差别较大。目前对乳酸菌细菌素的研究主要集中在classⅠ和classⅡ上，但只有乳酸链球菌素（nisin）和少数片球菌素（pediocin）真正用于商业化生产，其他的细菌素都还不能进行大规模的生产，其中一个主要原因就是乳酸菌细菌素产量低，不足以满足工业化生产要求。为此，本文综述了目前关于提高乳酸菌细菌素产量的方法，期望为加快乳酸菌细菌素工业化生产提供参考。

1 筛选乳酸菌细菌素高产菌株

当前国内外研究人员都致力于高产细菌素乳酸菌的筛选。LUO F等[5]从传统发酵牦牛乳中筛选得到了5株产细菌素的乳酸菌，对金黄色葡萄糖球菌（Staphylococcus aureus）和产气肠杆菌（Escherichia aerogenes）有较强抑制性；DE MARTINIS E C P等[6]从巴西肉制品中筛选得到了2株具有抗李斯特菌的明串珠菌（Leuconostocsp.）20和沙克乳酸杆菌（Lactobacillus sakei）29；PONCE A G等[7]从发酵蔬菜筛选得到了4株抗李斯特菌（Listeria monocytogenes）和沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的尿肠球菌（Enterococcus faecium）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、海氏肠球菌（Enterococcus hirae）和狗链肠球菌（Enterococcus canis）[7]；吕好新等[8]从发酵乳制品中筛选得到了一株产广谱细菌素的明串珠菌（Leuconostoc）；张小美等[9]从婴儿粪便中分离获得了一株对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制作用的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。虽然国内外研究人员在筛选产细菌素乳酸菌方面做了大量研究，但除了nisin外，实现产业化的乳酸菌细菌素鲜有报道。究其原因主要是还未发掘到能弥补nisin缺点、具有工业化前景的乳酸菌细菌素。目前classⅡa细菌素被认为是最有产业化前景的乳酸菌细菌素，但其筛选方法一般是应用琼脂扩散法，存在着筛选周期长、工作量大、重复性差等缺点。如何快速、有效的从蕴含大量乳酸菌的发酵食品中发掘获得高效、广谱的classⅡa乳酸菌细菌素是目前在该领域的研究热点。易华西等[10]根据classⅡa乳酸菌细菌素N端的保守氨基酸序列，建立了基于聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）技术的快速筛选方法；MACWANA S J等[11]根据目前已经报道的细菌素的氨基酸结构及基因序列等生物信息，开发出了类似于基因芯片的快速筛选方法。上述方法虽然具有快速的特点，但由于classⅡa细菌素的多样性，筛选靶点还存在特异性不强等缺点，目前有待开发一种快速、高效的高通量筛选方法。

2 发酵条件及培养基优化

发酵条件（发酵时间、pH、发酵温度、接种量等）影响着乳酸菌合成细菌素的能力。研究发现，初始pH和发酵温度对乳酸菌细菌素产量影响最大[12]。胡敏等[13]利用响应面法优化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HJD.A32产细菌素的发酵条件，发现当pH 5.3，发酵温度为30℃时细菌素的效价最高；马静等[14]研究发现尿肠球菌HY07产细菌素的优化发酵条件为pH 6，温度37℃。由此可见，乳酸菌产细菌素的最适pH和温度具有菌株特异性。通常来说，细菌素在指数增长前期开始合成，在指数增长末期或稳定前期达到最大值[15-16]。MATARAGAS M等[17]研究肠膜明串株菌（Leuconostoc mesenteroides）L124和弯曲乳杆菌（Lactobacilluscurvatus）L442合成细菌素时发现，这两株菌均在指数增长前期开始合成细菌素，直到指数增长末期达到最大值。尚楠等[18-19]也得到了相似的结论。接种量对乳酸菌产细菌素的影响目前存在着分歧，造成这一原因可能是细菌素的合成受到群体感应的调节。刘国荣等[20]的研究发现接种量对细菌素的合成影响不显著，但陈琳等[21]研究发现接种量对植物乳杆菌产细菌素的影响显著，仅次于初始pH的影响。通过优化发酵条件，虽然从一定程度上能提高乳酸菌细菌素的产量，但增产的幅度有限，并且产细菌素最适发酵条件一般与菌体最适生长条件不一致，不能解释其增产作用机制和调控机理，不能从根本上去解决提高乳酸菌细菌素产量的问题。

培养基成分（如碳源、氮源、无机盐等）对乳酸菌产细菌素也具有影响。ANASTASIADOU S等[22]研究了不同碳源（葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘油）对乳酸片球菌（Pedio coccusacidilactici）NRRLB5627产细菌素的影响，结果发现葡萄糖是最有利于产细菌素的碳源，而甘油对细菌素的合成有强烈的抑制作用。KIM M H等[23]发现酵母提取物、胰蛋白胨和高浓度的磷酸盐有利于微球菌（Micrococcussp.）GO5合成细菌素GO5。LI C等[24]研究了培养基成分对乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）ATCC 11454产细菌素的影响，结果发现硫酸镁浓度对于细菌素的产量没有显著影响。TODOROV S D等[25]认为最适于肠球菌产抗菌肽ST4SA的硫酸镁质量浓度为0.1 g/L。由于不同乳酸菌产细菌素所需的最适培养基成分浓度不同，所以通过优化培养基成分来提高乳酸菌细菌素产量的方法显然具有很大的局限性和不确定性。目前所用的培养基主要是MRS和M17或基于上述两种组分的改良培养基，从成本上考虑是不经济的。因此基于生产成本，国外研究者开展了经济型培养基的筛选和优化，比如利用乳清、工业废水、糖蜜等工业副产品[26]。

3 基因工程技术提高乳酸菌细菌素产量

利用基因工程技术来提高乳酸菌细菌素产量的研究主要集中在基因工程菌构建。目前产乳酸菌细菌素异源表达系统主要有3类：大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统、乳酸菌表达系统和酵母表达系统，其中以大肠杆菌表达系统研究最多。但是，利用大肠杆菌表达系统分泌的细菌素大多都不能释放到胞外，而是以融合蛋白形式存在于胞内。KLOCKE M等[27]将编码尿肠球菌产细菌素的基因导入大肠杆菌中使其表达，而其表达的细菌素存在于胞内。这就造成在提取纯化细菌素时需要对细胞进行裂解、酶解等过程，导致操作程序繁琐，并且还增加了成本[28]。此外，大肠杆菌本身并不是一般认为安全（generallyrecognizedassafe，GRAS）菌株，其表达产物是否可直接应用于食品工业还有待于进一步研究[29]。

乳酸菌表达系统克服了以大肠杆菌作为宿主存在的安全隐患，可以直接将构建的乳酸菌加入到食品中，免去了细菌素分离提纯等的步骤[30]。但是，目前对于乳酸菌作为宿主进行异源表达产细菌素的报道较少，主要的原因是其表达的细菌素活性不高。SANCHEZ J等[31]将肠球菌（Enterococcus）DCH5细菌素基因导入到乳酸乳球菌中，并使其表达相应的细菌素，结果却发现异源表达的细菌素活性不如原宿主菌产的细菌素活性强。另外，目前以乳酸菌为宿主的表达系统大多是以抗生素（氯霉素、红霉素等）作为筛选标记，从食品安全角度考虑，抗生素标记的表达系统是不能用于食品生产的。因此，寻找安全、无毒的筛选标记显得尤为重要。LIU G等[32]以nisin免疫基因（nisin Ι）为筛选标记，乳酸乳球菌为表达宿主，构建了完全食品级表达系统，从而产生安全、无毒的细菌素。

目前对于酵母异源表达细菌素的研究报道较少，主要问题与乳酸菌表达系统类似，宿主表达的细菌素无活性或活性较低。如BEAULIEU L等[33]利用毕赤酵母（Pichiapastoris）异源表达产生片球菌素Pediocin PA-1，虽然能产生胞外重组片球菌素，但胞外重组片球菌素无抗菌活性。总之，利用基因工程技术来提高乳酸菌细菌素产量的方法在理论上是可行的，但普遍存在着表达的细菌素活性较低等问题，因此找到一种能够表达高活性细菌素，并且构建出完全食品级表达系统是当前研究的重点。

4 诱导调控提高乳酸菌细菌素产量

近几年研究发现乳酸菌存在着调节细菌素合成的群体感应系统[34-35]，通过某种信号分子来诱导启动特定基因的表达。当前，利用诱导调控来提高乳酸菌细菌素产量的方法主要包括两种：自我诱导和外源诱导。自我诱导指的是菌体自身所分泌的某种物质可以诱导该物质的合成。例如，nisin不仅是一种具有抗菌活性的细菌素，还具有自我诱导合成功能。NILSEN T等[36]研究尿肠球菌（Enterococcus faecium）CTC492产细菌素的自我诱导功能时发现，尿肠球菌CTC492能分泌一种能诱导自身细菌素合成的诱导因子（induction factor，EntF），并且Entf诱导尿肠球菌CTC492细菌素的合成具有剂量依赖性。目前，国内对于研究自诱导提高乳酸菌细菌素产量的报道比较少。易华西[37]研究发现，副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）-J23产细菌素Bac-J23存在自我诱导现象，同样也体现出剂量依赖性。葛菁萍等[38]研究发现，添加细菌素Paracin1.7可使干酪乳杆菌（Lacto bacillus casei）HD1.7合成其产量提高10.72%。虽然，研究证明了乳酸菌产细菌素存在着自我诱导现象，但目前对于产细菌素相关的群体感应系统的研究还不够完善，自诱导物的调控机理及策略还不清楚。随着乳酸菌群体感应系统的深入研究，利用自我诱导提高乳酸菌细菌素产量的方法将成为新的研究热点。

外源诱导是指向培养液中加入非培养液成分的外源物质诱导细菌素的合成。通常认为前体物质或代谢中间产物具有诱导目标产物合成的作用。乳酸菌细菌素是蛋白质或多肽类物质，因此氨基酸可以作为合成乳酸菌细菌素的外源诱导物。另外，丙酮酸和甘油作为微生物代谢途径中合成的一种重要的中间代谢物，有可能参与细菌素的合成代谢。VÁZQUEZ J A等[39]研究氨基酸对nisin合成的影响时发现，半胱氨酸和色氨酸对nisin的合成有促进作用，而脯氨酸却不利于nisin的合成。易华西[37]以谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丙氨酸、丙酮酸和甘油为对象，发现半胱氨酸、甘氨酸、丙酮酸和甘油对细菌素Bac-J23的合成有诱导作用。ANASTASIADOU S等[22]研究发现，若以甘油为唯一碳源，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）NRRLB5627合成片球菌素的产量将明显降低，可能是甘油作为碳源不能使乳酸片球菌NRRL B5627很好的生长，导致其合成细菌素能力下降。利用外源物诱导提高乳酸菌细菌素产量的研究，目前还处于起始阶段，对其诱导机理和调控方法还有待于进一步的研究。

5 胁迫刺激乳酸菌合成细菌素

生态胁迫刺激一般可以分为2种形式：第1种是乳酸菌与其他微生物共培养（特别是敏感菌），为了获得有利生长环境，会大量释放细菌素来杀死或抑制其它微生物的生长；第2种是某些环境压力可以刺激菌体释放细菌素，从而更好的适应不良生长环境。MALDONADO A等[40]研究发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）NC8和尿肠球菌6T1a-20、戊糖片球菌FBB63等微生物共培养时，能显著的增加植物乳杆菌NC8合成细菌素；TABASCO R等[41]发现当嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）La-5与嗜热链球菌、德式乳酸杆菌等共培养时，能够增加其细菌素的产量。ROJO-BEZARES B等[42]分别以乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）MG1363、希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）J81和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）FBB63为诱导菌，与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）J23共培养，研究发现活的诱导菌并不是诱导细菌素合成所必需的，诱导物质没有释放到培养基中。然而，国内研究植物乳杆菌KLDS1.0706、KLDS4.0315、KLDS4.0351和罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）KLDS1.0736与植物乳杆菌KLDS 1.0391共培养时，发现活的诱导菌是植物乳杆菌KLDS 1.0391合成细菌素所必需的[43]，这与ROJO-BEZARESB等[42]的结果相矛盾。目前，利用微生物共培养方法提高乳酸菌细菌素产量的研究还不是很完善，共培养诱导物是蛋白质或肽类，还是诱导菌体细胞结构等对导机理还不清楚。

当乳酸菌在恶劣的环境下生长时，一些环境压力能刺激其细菌素的合成。乳酸菌对于恶劣环境的应答与乳酸菌本身的特性和施加环境压力类型有关。LEROY F等[44]研究不同环境压力（氧压力、盐压力、糖压力、营养素压力）对尿肠球菌RZSC5产细菌素的影响，结果表明，氧压力对细菌素的合成没有显著影响，而中等盐浓度（20～40 g/L）能够提高细菌素的活性，而当对糖和营养素进行限制时，其对细菌素产量没有影响；PAPAGIANNI M等[45]发现在溶解氧张力（dissolved oxygen tension，DOT）为100%和50%时，亚硝酸钠对类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）产细菌素有抑制作用，而在厌氧条件下时，亚硝酸钠对类肠膜魏斯氏菌产细菌素没有影响。目前，有关通过施加环境压力来提高乳酸菌细菌素产量的报道很少。主要是环境压力对合成细菌素的影响因素很复杂，而且其影响机理还不十分清楚。但随着在这样面的深入研究，相信通过环境压力来提高乳酸菌细菌素产量的方法将会有更大的突破。

6 总结与展望

目前，发酵条件优化仍然是提高乳酸菌细菌素最常用的方法，但存在费时、操作繁琐、工作量大、产量增加幅度较小、不确定因素多等缺点。利用基因工程技术来提高乳酸菌细菌素产量的方法一直被研究者所重视，但利用基因工程方法合成的细菌素存在着一个很大的问题，即安全性问题，更重要的是由于基因沉默、基因组的保守性问题等不一定能提高产量，利用诱导调控和胁迫应答提高细菌素产量是基于乳酸菌的代谢和生态的观点，不涉及安全性问题，而且这两个方法都被认为是在转录水平上的调节，也是最经济的调节方式。因此，利用诱导调控和胁迫应答来提高乳酸菌细菌素产量的方法必将成为该领域的研究热点，有望为乳酸菌细菌素的大规模生产提供新思路。

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Strategies to increase bacteriocin production by lactic acid bacteria

ZHANG Jianming,REN Luya,YI Huaxi*,ZHANG Lanwei

(Sino-France Dairy Joint Laboratory,School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

Bacteriocin by lactic acid bacteria as natural biological preservatives had been widely used in food industry due to the high efficient and non-toxic character.However,only nisin implemented industrialized production.The low bacteriocin production by lactic acid bacteria is one of the bottlenecks for its industrial production.Therefore,present methods available for increasing bacteriocin production by lactic acid bacteria were reviewed,which including high bacteriocin yield strain screening,fermentation conditions regulation,genetic engineering technology,induction regulation and stress stimulus response.It will provide some novel thoughts for increasing bacteriocin production by lactic acid bacteria.

lactic acid bacteria;bacteriocin;methods;production

Q939.92

A

0254-5071（2014）07-0029-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.006

2014-06-14

国家自然基金项目（30900996）；中国博士后基金特别资助项目（2012T50346）

章检明（1990-），男，硕士研究生，研究方向为乳品微生物。

*通讯作者：易华西（1976-），男，副教授，博士，研究方向为乳品微生物。