丹参联合葛根对糖尿病眼病模型大鼠的协同作用

唐洪梅，柴玉娜，涂 星，丘振文，张庆业（.广州中医药大学第一附属医院，广州 50405；.广州中医药大学第一临床医学院，广州 50006）

丹参联合葛根对糖尿病眼病模型大鼠的协同作用

唐洪梅1＊，柴玉娜2，涂 星2，丘振文1，张庆业1（1.广州中医药大学第一附属医院，广州 510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广州 510006）

目的：研究丹参联合葛根对糖尿病眼病模型大鼠的协同作用。方法：腹腔注射链脲佐菌素-弗氏完全佐剂联合喂饲高脂饲料以复制大鼠糖尿病眼病模型。实验分为正常对照（等容生理盐水）组、模型（等容生理盐水）组、葛根（33 g/kg）组、葛根丹参（33 g/kg+33 g/kg）组，灌胃给药，每天2次，连续15 d。于电镜下观察大鼠眼组织形态变化。分别灌胃葛根（33 g/kg）、葛根丹参（33 g/kg+33 g/kg），给药0、10、20、30、45、60、90、120、240、360、480min时取血，高效液相色谱法测定大鼠血浆中葛根素的血药浓度。色谱柱为DiamonsilC18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-水（25∶75，V/V），检测波长为250 nm，流速为1.0m l/min，柱温为25Ⅸ，进样量为10μl。以WinNonlin软件分析药动学参数。结果：模型组大鼠眼组织视网膜细胞萎缩，脉络膜血管增生、扩张、充血，出现新生血芽，内皮细胞核数目增多，给药后上述病理状态均得到改善，其中葛根丹参组改善情况优于葛根组。葛根素质量浓度在0.1～8.0mg/m l范围内与其同内标峰面积比值呈良好线性关系，精密度试验RSD均小于3%，稳定性试验RSD均小于4%，回收率在86.02%～90.28%。葛根组与葛根丹参组AUC分别为（156.49±32.62）、（462.27±119.86）mg·m in/L，cmax分别为1.426 5、1.986 2mg/m l，t1/2kα分别为（9.62±1.59）、（10.07±2.11）m in。结论：丹参与葛根配伍，可明显促进葛根素的体内吸收、分布，减缓其消除，促进葛根素在血液中的富集且能改善模型大鼠眼组织病变。丹参对葛根改善模型大鼠糖尿病眼病具有较好协同增效作用。

葛根；丹参；糖尿病眼病；协同增效；药动学；病理组织

糖尿病眼病是糖尿病最常见的慢性并发症之一，易引起患者视力减退甚至失明，是世界范围内重要的致盲性眼病[1-2]。丹参与葛根在临床上都用于治疗心脑血管疾病，葛根主要用于缺血性心脑血管病、眼底病、内耳病等，丹参具有活血化瘀、通脉养心的作用，两者配伍能起到较好的协同作用[3-6]。但是，丹参对葛根治疗糖尿病眼病的促进作用尚不明确，本研究通过观察丹参对葛根有效成分葛根素在模型大鼠体内的含量变化及对模型大鼠眼组织形态的影响，寻找丹参葛根配伍治疗糖尿病眼病的理论依据。

1 材料

1.1 仪器

6410 Triple Quad LC/MS系统，包括G1311A型四元泵、G1322A型脱气泵、G1329A型自动进样器、G1216A型柱温箱，Mass Hunter软件控制及数据处理系统（美国Agilent公司）；BFC2000型氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）；2K15C型高速离心机（美国Sigma公司）；超低温冰箱（法国Jouan公司）；涡旋振荡器（合肥艾本森科学仪器有限公司）；TP1020型自动脱水机、EG1140H型石蜡包埋机（德国莱卡仪器公司）；600型透射电镜（日本Hitachi公司）；2555型生物显微镜（日本Olympus公司）；乐康全微量血糖检测仪、血糖试纸（美国罗氏国际制药集团有限公司）。

1.2 药材

丹参、葛根均购自广州采芝林大药房，经笔者鉴定为真品。

1.3 药品与试剂

葛根素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：753-200007）；肝素（上海君创生物公司，批号：20130508，规格：150 u/mg）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；弗式完全佐剂（CFA，美国Gibco Brl公司）；乙腈（色谱纯，美国默克公司）；其余试剂均为分析纯。

1.4 动物

SPF级SD大鼠，5周龄，♂，由广州中医药大学实验动物中心提供[实验动物使用许可证号：SCXK（粤）2013-0020]。饲养环境：明暗各12 h，温度20～24Ⅸ，相对湿度：50%～70%。

2 方法

2.1 药效学研究

2.1.1 溶液的制备 （1）葛根提取液的制备：将葛根干燥粉碎成粗粉，称取500 g，加水煎煮2次，第1次加入10倍量水煎煮1.5 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至2 g/m l，贮藏，备用。（2）葛根丹参提取液的制备：称取葛根、丹参粗粉各250 g，按“2.1.1（1）”项下方法制备葛根丹参提取液，葛根、丹参质量浓度均为2 g/m l，贮藏，备用。

2.1.2复制模型与分组、给药 40只SD大鼠随机均分为4组，即正常对照（等容生理盐水）组、模型（等容生理盐水）组、葛根（33 g/kg）组、葛根丹参（33 g/kg+33 g/kg）组。ig给药，每天2次，连续15 d。大鼠每周1次，连续3周ip STZ（30 mg/kg，pH4.2柠檬酸钠缓冲液制备成0.1%，过0.22µm微孔滤膜，现配现用），ip STZ第2天ip等剂量CFA，正常对照组ip等容柠檬酸钠缓冲液。每周测定餐后血糖1次，血糖持续升高后喂饲高脂饲料（15%蔗糖、4%胆固醇、0.3%胆酸盐、10%猪油、10%蛋黄粉、61%基础饲料），正常对照组大鼠喂饲基础饲料。以餐后血糖值≥16.0mmol/L且＜20.0mmol/L为模型复制成功。

2.1.3 形态学观察 末次给药第2天，将大鼠脱颈椎处死，剥离眼球，置于10%福尔马林中固定，制作石蜡切片，HE染色，置于电镜下观察其组织形态变化。

2.2 药动学研究

2.2.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（25∶75，V/V）；检测波长：250 nm；流速：1.0m l/min；柱温：25Ⅸ，进样量：10μl。

2.2.2 溶液的制备 （1）对照品溶液的制备：精密称取于五氧化二磷干燥器中干燥至恒质量的葛根素对照品10mg，置10 m l量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制备成质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/m l的对照品溶液，4Ⅸ贮藏，备用。（2）内标溶液的制备：精密称取于五氧化二磷干燥器中干燥至恒质量的对羟基苯甲酸0.3 g，置10 m l量瓶中，加甲醇-5%冰醋酸（1∶4，V/V）溶解并定容至刻度，摇匀即得质量浓度为30 g/L的内标溶液，4Ⅸ贮藏，备用。（3）质控样品的制备：分别取不同质量浓度的对照品溶液10μl与内标液10μl，置100μl空白血浆中，得质量浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/ m l的血浆样品，－20Ⅸ贮藏，备用。

2.2.3 血浆样品的处理 取血（含药血）样品置于肝素处理晾干的离心管中，以离心半径为8 cm、3 000 r/m in离心15m in，分离得血浆，－20Ⅸ贮藏，备用。取血浆100µl，依次加入甲醇25µl、对羟基苯甲酸溶液25µl，涡旋混合1m in，然后加入甲醇1.0m l涡旋3min，以离心半径为8 cm、10 000 r/min离心15 min，取上清液在50Ⅸ氮气吹干，残渣以甲醇-水（25∶75，V/V）复溶，以离心半径为8 cm、10 000 r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，10μl进样。

2.2.4方法学考察 （1）专属性考察：分别取0.2m l空白血浆、0.2m l空白血浆+对照品+内标、0.2m l给药后大鼠血浆样品，按“2.2.3”项下方法处理样品后，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，葛根素的保留时间约为19.23min，内标对羟基苯甲酸的保留时间约为10.74m in，血浆中所含的内源性物质不干扰被测物和内标的测定，且二者峰形良好。理论板数不低于3 000。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.葛根素对照品；C.葛根组含药血样（120m in）；D.葛根丹参组含药血样（120m in）；1.葛根素Fig 1 HPLC chrom atogram sA.blank plasma；B.puerarin control；C.blood sample of Radix Puerarin group（120m in）；D.blood sample of S.miltiorrhiza and Radix Puerarin group（120min）；1.puerarin

（2）标准曲线的制备：按“2.2.2（1）”项下方法制备对照品系列溶液，按“2.2.3”项下方法处理，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。以葛根素质量浓度（x）为横坐标，待测物与内标峰面积比值为纵坐标（y），进行线性回归，得回归方程为y＝1.565 3x+ 0.257 6（r＝0.999 8）。结果表明，葛根素质量浓度在0.1～8.0 mg/m l范围内与待测物同内标峰面积比值呈良好线性关系。（3）精密度试验：按“2.2.2（3）”项下方法制备高、中、低质量浓度（8.0、2.0、0.5mg/m l）的质控样品5份，按“2.2.3”项下方法处理，按“2.2.1”项下色谱条件测定日内精密度（5次）、日间精密度（5 d）。结果，高、中、低质量浓度质控样品日内精密度RSD分别为2.42%、1.42%、1.03%；日间精密度RSD分别为2.92%、1.71%、1.27%，表明仪器的精密度良好。（4）绝对回收率试验：取“2.2.4（3）”项下高、中、低质量浓度质控样品5份，按“2.2.3”项下方法处理，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积。取上述未处理的血浆样品直接进样，测定峰面积。以两峰面积之比计算质控样品的回收率，高、中、低质量浓度质控样品的绝对回收率分别为86.02%、87.74%、90.28%。（5）稳定性试验：取“2.2.4（3）”项下高、中、低质量浓度的质控样品各5份，置于室温贮藏（25Ⅸ），24 h后测定，考察血浆样品的常温短期稳定性；取“2.2.4（3）”项下高、中、低质量浓度的质控样品各5份，冷冻贮藏于－20Ⅸ，24 h后测定，考察血浆样品的低温短期稳定性；取“2.2.4（3）”项下高、中、低质量浓度的质控样品各5份，冷冻贮藏于－20Ⅸ，在室温中充分解冻，然后再次冷冻，每次间隔8 h，重复3个冻融周期后测定，考察血浆样品的3周期冻融稳定性。结果，上述3个试验RSD分别为2.76%、1.10%、3.96%，表明葛根素在血浆样品中稳定性良好。

2.2.5大鼠药动学测定 12只模型大鼠实验前禁食12 h，自由饮水，均分为2组，即葛根（33 g/kg）组、葛根丹参（33 g/kg+ 33 g/kg）组，分别于给药10、20、30、45、60、90、120、240、360、480m in后从大鼠眼底静脉丛取血0.5m l，按“2.2.3”项下方法处理后进行测定，计算大鼠血浆中葛根素质量浓度，制备葛根素在各时间点的浓度-时间曲线。数据以WinNonlin软件进行处理分析。

3 结果

3.1 大鼠眼组织与视网膜切片

正常对照组大鼠视网膜表面光滑，各层组织结构清晰，神经细胞未见变性、萎缩等改变；脉络膜血管未见增生，未见脉络膜新生血管芽突破内界膜；晶体及角膜未见明显病变。模型组大鼠视网膜外颗粒层细胞轻度萎缩，较正常对照组稍变薄；脉络膜小血管增生、扩张、充血，可见突破内界膜的新生血管芽，突破内界膜的内皮细胞核数明显增多；晶体及角膜未见明显病变。葛根组大鼠脉络膜局部小血管轻度充血，突破内界膜的内皮细胞核数增多，新生血芽减少，视网膜基本恢复正常；晶体及角膜未见明显病变。葛根丹参组大鼠脉络膜局部小血管充血现象减少，突破内界膜的内皮细胞核与新生血芽基本消失，视网膜基本恢复正常；晶体及角膜未见明显病变。大鼠眼组织与视网膜切片见图2、图3。

3.2 大鼠药动学结果

图2 大鼠眼组织切片（HE染色，200×）A.正常对照组；B.模型组；C.葛根组；D.葛根丹参组Fig 2 Eye tissue image of rats（HE staining，200×）A.normal control group；B.model group；C.Radix Puerarin group；D.S. miltiorrhiza and Radix Puerarin group

图3 大鼠视网膜切片（HE染色，400×）A.正常对照组；B.模型组；C.葛根组；D.葛根丹参组Fig 3 Retina imageof rats（HE staining，400×）A.normal control group；B.model group；C.Radix Puerarin group；D.S. miltiorrhiza and Radix Puerarin group

大鼠ig葛根提取液和葛根丹参提取液后，葛根素的浓度-时间曲线符合开放二室模型。葛根丹参组cmax、AUC均高于葛根组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明丹参联合葛根用药，能促进葛根素的吸收。与葛根组比较，在分布过程中，葛根丹参组的t1/2α降低，V/F（C）减小，差异有统计学意义（P＜0.05），表明丹参联合葛根能加快葛根素在大鼠体内的分布且促进葛根素在血液中富集，增加血药浓度；在代谢和排泄过程，葛根丹参组的CL（S）减小，t1/2β延长，差异有统计学意义（P＜0.05），说明丹参与葛根配伍能减缓葛根素在大鼠体内的消除速率，从而延长葛根素的体内作用时间，起到长效的目的。浓度-时间曲线见图4；药动学参数见表1。

图4 浓度-时间曲线（±s，n＝6）Fig 4 Plasma concentration-time curve of puerarin（±s，n＝6）

表1 药动学参数（±s，n＝6）Tab 1 Kinetic parametersof puerari（n±s，n＝6）

表1 药动学参数（±s，n＝6）Tab 1 Kinetic parametersof puerari（n±s，n＝6）

药动学参数t1/2α，min t1/2β，min t1/2 kα，min cmax，mg/ml tpeak，min CL（S），L/（min·kg）V/F（C），L/kg AUC，mg·min/L数值葛根组14.13±2.17 111.45±32.73 9.62±1.59 1.4265 30 1.43±0.61 216.23±52.71 156.49±32.62葛根丹参组7.30±3.63＊376.14±89.67＊10.07±2.11 1.9862 40 0.55±0.18＊89.62±23.39＊462.27±119.86＊

4 讨论

糖尿病眼病并发症临床主要表现为视网膜病变和白内障，其中增殖型视网膜病变是致盲的主要原因，约占视网膜病变的60%[7]，目前临床上尚无特效治疗药物，醛糖还原酶抑制剂的使用备受争议[8-9]。而动物模型在研究疾病的发生机制及治疗作用机制上具有重要的作用[10]。笔者前期曾以STZ联合高脂饲料法诱导糖尿病大鼠模型，发现复制的模型能较好的反映出模型动物脑、肾、脂肪、胰腺的改变，未见眼组织形态变化[11]。故本研究根据李璇等[12-13]所采用的STZ-CFA加高脂饲料复制大鼠糖尿病眼病模型，发现该模型能较好的反映出大鼠视网膜病变的特征，但是尚未见晶体及角膜的病变。

本研究从药动学和药效学两个角度观察丹参对葛根素的协同作用。结果表明，丹参与葛根配伍后能明显增加葛根素AUC，提高cmax，降低t1/2α，延长t1/2β，说明丹参能够促进葛根素在大鼠体内的吸收过程，加快其体内分布，且可延缓其代谢和排泄，从而达到提高其生物利用度并延长药物在大鼠体内的作用时间的目的，以保证葛根“升精以养”和“输肌以散”之功起到较好的协同增效作用。有报道葛根和丹参合用可以治疗视网膜静脉阻塞（RVO）[14]，本研究结果也证实了葛根和丹参配伍使用能够较好的清除糖尿病眼病并发症引起的视网膜血芽增殖，减少脉络膜局部小血管充血，且二者联用具有较好的协同作用。但是二者配伍后，丹参和葛根主要活性成分之间的药物是如何发生相互作用及相关的作用机制尚不明确，尚待进一步研究。

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Synergistic EffectofSalviam iltiorrhizato Radix Puerarin in the Treatmentof Diabetic Eye DiseaseM odelRats

TANG Hong-mei1，CHAIYu-na2，TU Xing2，QIU Zhen-wen1，ZHANG Qing-ye1（1.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China；2.The First Clinical Medical College，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To study synergistic effect ofSalviamiltiorrhizato Radix Puerarin in the treatment of diabetic eye disease model rats.METHODS：Steptozotocin（STZ）-complete Freund′s adjuvant（CFA）combined w ith high fat fodder were used to establish diabetic eye disease model.Model rats were divided into normal control group（constant volume of normal saline），model group（constant volume of normal saline），Radix Puerarin group（33 g/kg），S.miltiorrhizaand Radix Puerarin group（33 g/ kg）.They were given relenvantmedicine intragastrically tw ice a day for consecutive 15 days.The histopathologic changes of eyes were observed under TEM.They were given Radix Puerarin（33 g/kg+33 g/kg），S.miltiorrhizaand Radix Puerarin（33 g/kg）intragastrically；blood samples were collected 0，10，20，30，45，60，90，120，240，360 and 480 m in aftermedication.Plasma concentration of puerarin was determ ined by HPLC.The determ ination was performed on Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）column w ithmobile phase consisted ofmethanol-water（25∶75，V/V）at the flow rate of 1.0m l/min.The detection wavelength was set at 250 nm，and column temperature was 25Ⅸ.The sample size was 10μl.The pharmacokinetic parameters were analyzed w ith WinNolin software.RESULTS：In model group，rats suffered from retinal cellular atrophy，chorioid vascular proliferation，dilatation and congestion，vascular bud，the increase of vascular endothelial cells nucleus；above symptomswere all improved aftermedication，and the improvement ofS.miltiorrhizaand Radix Puerarin group was better than that of Radix Puerarin group.The linear range of puerarin were 0.1-8.0 mg/m l；RSD of precision testwas lower than 3%and that of stability testwas lower than 4%；recovery rates were 86.02%-90.28%.Pharmacokinetic parameters of Radix Puerarin group vs.S.miltiorrhizaand Radix Puerarin group were as follow s：AUC were（156.49±32.62）mg·m in/L vs.（462.27±119.86）mg·m in/L；cmax were 1.426 5 mg/m l vs. 1.986 2 mg/m l；t1/2kαwere（9.62±1.59）m in vs.（10.07±2.11）m in.CONCLUSIONS：The combination ofS.miltiorrhizaand Radix Puerarin can promote the absorption and distribution of puerarin，slow down the elimination rate，and bring the enrichment of puerarin in the blood.In addition，eye tissue lesions can be improved.Compatibility ofS.miltiorrhizaand Radix Puerarin show a synergistic effect on diabetic eye disease.

Radix Puerarin；Salvia miltiorrhiza；Diabetic eye disease；Synergistic effect；Pharmacokinetics；Histopathologic tissue

R285；R969

A

1001-0408（2014）11-0977-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.11.07

＊主任中药师，教授，博士研究生导师。研究方向：中药新药开发与安全性评价。电话：020-36588708。E-mail：tanghongmei2000@163. com

2014-01-09

2014-02-15）