乳腺癌CYP1B1基因多态性与ER、PR表达的关系

国玉芝，曲秀梅，太史婧华，方 芳，张志国

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

细胞色素P4501B1 (cytochrome P450 1B1,CYP1B1)是细胞色素P450超基因家族成员之一，被认为其基因在癌症特异性高表达[1]及由于其影响雌激素受体(estrogen receptor，ER)和孕激素受体(progesterone receptor，PR)表达而成为多种女性癌症(乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌)的致病基因[2～4]，但是不同研究者得出的结论不尽相同。本文力图通过检测乳腺癌手术患者血液CYP1B1 SNP rs1056827、rs1056836基因多态性与病理组织ERα、PR表达的关系及病理组织与癌旁组织CYP1B1表达与乳腺癌的关系，从而为临床诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院2010～2013年末乳腺癌手术患者作为研究对象，手术前采集患者血样留作检测CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836基因多态性样本，手术时留存病理及癌旁组织石蜡包埋组织块作为检测CYP1B1、ERα、PR表达样本。

仪器:S1000 Thermal Cycler PCR仪、PowerPac Universal 通用型电泳仪、ChemiDoc XRS 凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；H2500R-2高速冷冻离心机(上海沪誉贸易有限公司)。

试剂:Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit、Thermo Scientific Maxima Hot Start Green PCR Master Mix (2X)、GeneRuler 100 bp DNA Ladder、Thermo Scientific FastDigest Eam1105 I、Thermo Scientific FastDigest AleI 内切酶，以上试剂为Fermentas公司生产。CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司北京测序部完成。SP试剂盒、ERa鼠抗人单克隆抗体、PR鼠抗人单克隆抗体、兔抗人CYP1B1多克隆抗体，购自上海科彩生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因检测

CYP1B1 SNP rs1056827 PCR引物：F 5＇...CTCGTT-CGCTCGCCTGGCGC ...3＇R 5＇...GAAGTTGCGCATC-ATGCTGT...3＇;CYP1B1 SNP rs1056836 PCR引物：F 5＇...ATGCGCTTCTCCAGCTTTGT...3＇R 5＇...TATGGAGCACACCTCACCTG...3＇；扩增体系：Thermo Scientific Maxima Hot Start Green PCR Master Mix (2X)12.5μL，F、R primer各1μL，血液DNA 1μL，ddH2O 9.5μL；PCR条件：预变性95℃4min、变性95℃30s、退火56℃30s，延伸72℃30s，72℃末延伸5min；共35个循环；酶切体系及条件：10X FastDigest Green Buffer 2μL，FastDigest enzyme 1μL(rs1056827使用Eam1105I，rs1056836使用AleI)，ddH2O 17μL，PCR 产物10μL；水浴37℃酶切10min，然后取出立即置水浴65℃灭活5min。电泳：使用2%琼脂糖凝胶，电压145V，电泳45min。观察结果及拍照：电泳结束，把凝胶从胶板上取出，放到凝胶成像系统中按凝胶成像仪中观察结果并拍照。

1.2.2 ERa, PR免疫组化检测

(1)切片：乳腺癌病理标本同时制成约5μm厚切片，(2)脱蜡：切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次，每次10min；(3)洗涤切片：经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2 次(每次2min)，85%乙醇2min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O洗2次，每次2min；(4)抗原修复：浸入枸椽酸钠缓冲液中微波炉抗原修复20min，自然冷却，滴加1：200稀释的兔抗人CYP1B1抗体(一抗)，完全覆盖组织，4℃过夜。加山羊血清封闭10min,倾去封闭液，滴加二抗工作液，37℃水浴床孵育30min。滴加高敏过氧化物酶，37℃水浴床孵育30min。滴加新鲜配制的DAB溶液，显色10min，自来水冲洗，苏木素轻度复染1min，盐酸乙醇分化，淡氨水返蓝，脱水，中性树胶封固。每次染色均以已知阳性的乳腺癌切片作为CYP1B1阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 统计学分析

基因型分布和等位基因频率经χ2检验计算器v1.61进行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

图1 CYP1B1 扩增产物酶切后电泳

A rs1056827，L 100bp DNA Ladder ;2、5 G/G野生型纯合子，1、3 G/T杂合子，4、6 T/T突变型纯合子； B rs1056836, L 100bpDNA Ladder ;1、3、6、C/C野生型纯合子，2、5 C/G杂合子，4 G/G突变型纯合子。

2 结果

2.1 基因型分析

CYP1B1 SNP rs1056827扩增产物为250bp。野生型纯合子 G/G为250bp一条带；杂合子G/T为114、136、250bp三条带；突变型纯合子T/T为：114、136bp两条带。CYP1B1 SNP rs1056836 PCR扩增产物623bp，野生型纯合子C/C为491、132bp两条带；杂合子C/G为623、491、132bp三条带；突变型纯合子 G/G为623bp一条带。CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836扩增产物酶切后电泳结果如图1。

2.2 CYP1B1、Era、PR免疫组化分析

判断标准:Era、PR、CYP1B1着色部位在细胞核，胞核有棕黄色颗粒即判断为Era、PR、 CYP1B1表达阳性。阳性细胞数<5%记为阴性(-)，阳性细胞数>5%记为阳性(+)。不同CYP1B1基因型Era、PR表达情况，见表1。

表1 CYP1B1基因多态性与ERa, PR表达

通过χ2检验，各基因型与ERa, PR阳性表达之间的差异没有显著性，按照常规比较方法，将CYP1B1 rs1056827、1056836 GT、TT，CG、GG基因型合并后比较，基因型与ERa, PR阳性表达之间的差异也没有显著性，因此CYP1B1 rs 1056827，1056836基因多态性与ERa, PR阳性表达之间可能没有关系。120例乳腺癌病理组织及癌旁组织CYP1B1表达分别为106和0例，说明CYP1B1的过表达与乳腺癌相关。

3 讨论

有研究认为肿瘤组织CYP1B1 rs1056836基因多态性与ERa, PR阳性表达之间相关[2]，也有研究认为乳腺癌肿瘤组织CYP1B1 rs1056836基因多态性与ERa, PR阳性表达之间不相关[3]，本研究结果与刘春莲研究结果相同，即CYP1B1 SNP rs1056827，rs1056836基因多态性与ERa, PR阳性表达之间没有关系。有研究者认为CYP1B1在多种肿瘤组织中(如乳腺、子宫、肾、结直肠等)特异性高表达，而在相应的正常组织中不表达[1]，我们的研究与文献报道一致，即CYP1B1在肿瘤组织表达率非常高，而在非肿瘤组织中不表达，本研究证实了这种理论。

[1]肖昌琼，周宏灏.细胞色素P450药物氧化酶基因多态性与乳腺癌易感性研究进展[J].中国肿瘤，2009，18(1):38-40

[2]朱壮彦,糜若然,刘静，等.CYP1B1基因多态性与卵巢癌易感性的研究[J].现代妇产科进展，2006,15(3):184-187

[3]刘春莲，顾继伟，彭亮，等.CYP1B1 SNPrs1056836、ER和PR与宁夏汉族乳腺癌遗传易感性研究[J].中国肿瘤，2009,18(1):31-33

[4]陈悦，邓觐云，李张云，等.乳腺癌CYP1B1基因与ER、PR的表达关系及临床意义[J].江西医药，2009，44(12)：1176-1178