绞股蓝总皂苷对光老化人皮肤成纤维细胞Caspase-3信号通路的影响

王继慧，张小卿，马月丹，张 燚，马贤德，吴景东

在整体、器官、细胞和基因、蛋白水平上找到可测量的异常，已成为中外医学的研究趋势[1]。皮肤光老化即因长期或急性大剂量受到日光照射所导致的皮肤损伤和衰老。皮肤衰老(包括光老化)现代机制可阐述为，细胞的遗传基因调控是根本，自由基的作用可能为内因，细胞代谢障碍是基础，环境因素包括光损伤为外因的衰老机制理论。细胞凋亡被认为是机体稳态维持和DNA损伤细胞清除的重要调节机制。细胞凋亡可调节皮肤发育，在维持皮肤生理稳态和避免肿瘤发生中起关键作用[2]。但是，细胞凋亡过多，会导致机体免疫力下降，容易激发感染，一些人类皮肤病就是以细胞凋亡的增加为特征[3]。长波紫外线(UVA)照射细胞后，首先在细胞内产生大量活性氧，成为皮肤光损伤的主要因素。过量的活性氧会导致细胞氧化应激并产生细胞凋亡转录因子，引起细胞凋亡[4]。研究认为，经紫外线辐射受损的细胞，如果其损伤修复率提高，凋亡率就明显下降[5]。

杨靓[6]研究发现，绞股蓝可以显著影响细胞凋亡发生途径和结果，细胞凋亡与Caspase信号通路密切相关；绞股蓝总皂苷(Gyp)具有较强的清除自由基、抗氧化等作用[7]。提示绞股蓝对光老化皮肤细胞凋亡可能有保护性影响。人皮肤结构中，真皮内的成纤维细胞具有合成和分泌蛋白质并参与组织损伤后修复的功能。但关于绞股蓝对光老化人皮肤成纤维细胞(HSF细胞)凋亡影响的实验研究目前还十分少见。本实验通过观测Gyp含药血清对光老化HSF细胞凋亡及相关基因和蛋白的调控，通过探讨Caspase-3信号通路对细胞凋亡的调控作用，期望能揭示Gyp对光老化HSF细胞凋亡的保护性影响。本实验采用的永生化HSF细胞作为可在体外传代的永生化细胞无成瘤性，与正常HSF细胞分化特性高度相似，是研究HSF细胞的良好工具。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择雄性SPF级SD大鼠20只，体质量(200±20)g，购于中国医科大学，常规颗粒饲料喂养，自由饮水，12 h昼夜节律。

1.2 实验试剂 HSF细胞购于上海艾研生物科技有限公司；Gyp购于成都曼斯特生物科技有限公司(批号：MUST-11031401)；细胞蛋白提取试剂(批号：P0013)、BCA法蛋白定量试剂盒(批号：P0012S)、ECL发光液(批号：P0018)购于碧云天生物科技有限公司。

1.3 实验设备 电热恒温振荡器(SHA-B型)常州国华仪器设备厂生产；酶标仪(antho2010型)奥地利Anthos公司生产；凝胶成像分析系统(ChemiImager5500型)美国Alphainnotech Chemi Imager生产；水平摇床(WD-9405B型)北京六一仪器厂生产；垂直板电泳装置(Mini-Protein Ⅲ型)美国Bio-Rad公司生产；电泳仪(EPS300)上海天能科技有限公司生产；转印电泳槽(DYY 40B型)北京六一仪器厂生产；UBA(UV)光源(20 W)订制于南京华强电子有限公司；紫外光光度计(UV-340A型)台湾路昌电子仪器有限公司生产。

1.4 实验方法

1.4.1 含药血清的制备、细胞培养和光老化模型复制 将20只大鼠按照随机数字表法平均分为4组，分别是正常血清组和低、中、高剂量含药血清组，每组5只。根据Meeh-Rubner公式，算出200 g体质量大鼠每天给药量大约80 mg，并以此作为低剂量含药血清组大鼠日给药量，中剂量含药血清组给药量是低剂量含药血清组的2倍，高剂量含药血清组给药量是低剂量含药血清组的4倍。将Gyp溶于0.9%氯化钠溶液后灌胃，1次/d，共7 d，等第7天灌胃结束1 h后，主动脉取血，于促凝管内，室温静置1 h，1 200×g离心10 min，收集上清液。将每组大鼠血清分别收集于同一50 ml离心管中，置于56 ℃水浴中灭活，0.22 μm过滤灭菌，冻存备用。用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，37 ℃，5%二氧化碳(CO2)环境中培养HSF细胞，隔日传代。参照陶冶等[8]研究进行光老化HSF细胞模型复制：紫外线的照射剂量计算方法参考文献[9]，照射剂量(J/cm2)=照射强度(W/cm2)×照射时间(s)，通过紫外线辐照计测量照射强度，使照射剂量达到36 J/cm2。将处于对数生长期的HSF细胞消化成单细胞悬液，以1×104个/ml的浓度接种于另一培养瓶，5 ml/瓶，共接种25瓶。连续培养24 h后，弃去旧培养液，加入适量的磷酸盐缓冲液(PBS)，反复洗至PBS无色，加入PBS，2 ml/瓶，于UVA下照射。光源选用UVA 365 nm灯管，采用5根并排照射。培养瓶距灯源15 cm，待照射稳定后测量UVA的照射功率。

1.4.2 实验分组及含药血清干预 取处于对数生长期的HSF细胞，弃去旧培养液，以0.25%胰酶消化后加入新鲜培养液制成细胞悬液，以1×104个/ml接种于25 cm2的培养瓶中，共计30瓶，共分为6组。其中，随机抽取5瓶，作为空白对照组，正常培养，不施加任何干预因素。其余25瓶细胞，于37 ℃，CO2培养箱培养48 h后，弃去旧培养液，PBS清洗3次至PBS无色，加入2 000 μl PBS，放在UVA下照射，待照射稳定后测量UVA的照射功率，选择36 J/cm2UVA剂量建立光老化HSF细胞模型。将上述所剩的25瓶经过UVA照射的细胞随机分为5组，采取不同干预方法，分别为UVA模型组、正常血清干预组、低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组和高剂量含药血清干预组，每组5瓶。其中，UVA模型组HSF细胞经照射后，弃去PBS，加入5 ml新鲜培养液培养12 h；正常血清组HSF细胞经UVA照射后，弃去PBS，加入5 ml含10%正常大鼠血清的新鲜培养液培养12 h；低、中、高剂量含药血清干预组HSF细胞经UVA照射后，弃去PBS，分别加入5 ml含10%低、中、高剂量大鼠含药血清的新鲜培养液培养12 h。

1.5 指标检测

1.5.1 采用二氯荧光素(DCF)法检测UVA诱导的细胞活性氧表达 接种细胞：96孔板，接种细胞数为1.5万/孔。二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)孵育：接种24 h后用有糖Earle′s液洗两遍，并换上终浓度为25 μmol/L DCFH-DA培养箱孵育30 min。处理：DCFH-DA孵育结束后，再用有糖Earle′s液洗两遍给予处理。酶标仪检测荧光强度。

1.5.2 增殖反应测定 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测各组HSF细胞活性。无菌操作取各组单个细胞悬液，用Hanks液洗3次，每次离心10 min(800×g)。用苔盼蓝计数活细胞数为96%，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整浓度至5×108/ml，将细胞悬液加入96孔培养板，100 μl/孔。分别设定刺激孔和对照孔，刺激孔加入Con-A(终浓度为5 μg/ml)，对照孔加入等量的RPMI-1640培养液，同时刺激孔和对照孔再设3个平行孔，混匀后，将培养板置于37 ℃含5%CO2培养箱中，培养72 h。在培养结束前4 h取出培养板，向每孔中加入噻唑蓝15 μl(5 g/L)，继续培养4 h后，轻轻弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，在振荡器上振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上490 nm波长处测各孔光密度值(OD值)。

1.5.3 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blotting法检测细胞Caspase-3 mRNA和蛋白表达情况 RT-PCR：分别进行光老化各组HSF细胞总RNA提取、cDNA第一链合成、PCR和琼脂糖凝胶电泳实验。在波长为254 nm的紫外灯下观察实验结果，于凝胶成像系统中拍照并保存数据。Western-blotting：收集细胞，PBS漂洗并裂解细胞，然后测定Caspase-3浓度，30%聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，将丽春红染色过的PVDF膜用去离子水漂洗3次，洗去红色条带。置于25 ml封闭液中，室温摇床上缓慢摇动1 h，一抗稀释于封闭液中4 ℃摇晃过夜，三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS/T)漂洗3次；二抗稀释于封闭液中，室温摇晃1 h，再以TBS/T漂洗3次，蛋白信号由ECL试剂盒检测，记录结果。

2 结果

2.1 各组HSF细胞活性氧水平比较 6组HSF细胞活性氧(平均荧光强度)及活性氧水平比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；其中与空白对照组比较，UVA模型组、正常血清干预组、低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组和高剂量含药血清干预组HSF细胞活性氧(平均荧光强度)及活性氧水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与UVA模型组和正常血清干预组比较，低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组HSF细胞活性氧(平均荧光强度)及活性氧水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01，见表1)。

表1 6组HSF细胞活性氧水平比较Table 1 Comparison of reactive oxygen species in each group of HSF

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与UVA模型组比较，▲P<0.01；与正常血清干预组比较，△P<0.01

2.2 各组HSF细胞增殖活性比较 6组HSF细胞OD值比较，差异有统计学意义(P<0.01)；其中与空白对照组比较，UVA模型组、正常血清干预组、低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组OD值降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与UVA模型组及正常血清干预组比较，中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组OD值升高，差异均有统计学意义(P<0.01，见表2)。

表2 6组HSF细胞OD值比较Table 2 Comparison of OD of each group of HSF

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与UVA模型组比较，▲P<0.01；与正常血清干预组比较，△P<0.01

2.3 各组HSF细胞Caspase-3 mRNA表达水平比较 6组HSF细胞Caspase-3 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.01)；其中与空白对照组比较，UVA模型组、正常血清干预组、低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组Caspase-3 mRNA表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与UVA模型组及正常血清干预组比较，低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组Caspase-3 mRNA表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与低剂量含药血清干预组比较，中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组Caspase-3 mRNA表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与中剂量含药血清干预组比较，高剂量含药血清干预组Caspase-3 mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.01，见表3、图1)。

2.4 各组HSF细胞Caspase-3表达水平比较 6组HSF细胞Caspase-3表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.01)；其中与空白对照组比较，UVA模型组、正常血清干预组、低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组Caspase-3表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与UVA模型组和正常血清干预组比较，低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组Caspase-3表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与低剂量含药血清干预组和中剂量含药血清干预组比较，高剂量含药血清干预组Caspase-3表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01，见表4、图2)。

3 讨论

中国医学典籍中的“阳淫”“明淫”致病学说，讨论了日光过度照射而致热疾的发病机制。中医诊治的面部损美性疾病如黧黑斑、雀斑和黑变病等，病因病机都涉及日光照射皮肤所致的损害，提示光毒是诱发皮肤损伤乃至日久引起皮肤老化和损美性疾病的主要外感因素[10]。

注：A空白对照组，B UVA模型组，C正常血清干预组，D低剂量含药血清干预组，E中剂量含药血清干预组，F高剂量含药血清干预组

图1 RT-PCR法检测各组HSF细胞中Caspase-3 mRNA表达

Figure1 Caspase-3 mRNA expression of each group of HSF determined by RT-PCR

表3 6组HSF细胞Caspase-3 mRNA表达水平比较Table 3 Comparison of Caspase-3 mRNA expression of each group of HSF

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与UVA模型组比较，●P<0.01；与正常血清干预组比较，△P<0.01；与低剂量含药血清干预组比较，▲P<0.01；与中剂量含药血清干预组比较，☆P<0.01

表4 6组HSF细胞Caspase-3表达水平比较Table 4 Comparison of Caspase-3 protein expression of each group of HSF

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与UVA模型组比较，●P<0.01；与正常血清干预组比较，△P<0.01；与低剂量含药血清干预组比较，▲P<0.01；与中剂量含药血清干预组比较，☆P<0.01

注：A空白对照组，B UVA模型组，C正常血清干预组，D低剂量含药血清干预组，E中剂量含药血清干预组，F高剂量含药血清干预组

图2 Western-blotting法检测各组HSF细胞中Caspase-3表达

Figure2 Caspase-3 protein expression of each group of HSF determined by Western-blotting

中药绞股蓝味甘微苦性寒，归脾肺肾三经，具益气养阴、健脾胃、清肺热之功。现代实验研究发现，Gyp有显著镇静、镇痛、抗氧化、抗疲劳等作用，与皮肤光老化损伤的防治目标相吻合[11-13]。

近年体内研究证实，绞股蓝具有一定的抗皮肤光老化作用[14]。Gyp为绞股蓝主要药理成分，其药理作用可能与绞股蓝有相似之处。故在本研究中，将Gyp作为干预因素施加于大鼠，以制备含药血清。

研究表明，紫外线辐射可使HSF细胞的胶原合成减少，使皮肤失去紧致和弹力，产生皮肤皱纹，并诱导光老化发生[15]。皮肤光老化与UVA诱导细胞凋亡发生密切相关。本研究证实，UVA模型组HSF细胞凋亡显著增加。当采用Gyp含药血清干预后，细胞增殖活性则明显上升，且高剂量含药血清组干预效果最为显著，提示Gyp对细胞的积极作用。

细胞在生理状态下，通过正常代谢过程而产生的各种活性氧，在抗氧化物质作用下能够及时被清除。当紫外线作用于细胞，首先是细胞内发色基团(包括：DNA、尿刊酸、芳香族氨基酸等)吸收其电磁能量，并将其转化为化学能量，譬如与氧分子相互作用，产生活性氧簇[16-17]。当细胞受到过度刺激而使活性氧产生过多，可导致细胞细胞凋亡甚至坏死。本研究中UVA诱导细胞产生过量活性氧，提示活性氧在紫外线光老化中起着重要作用，这与以往实验结果一致[18]。而Gyp含药血清干预后HSF细胞中活性氧水平下调，表明绞股蓝可以缓解或减轻紫外线诱导的光老化HSF细胞毒性，并使损伤得到明显恢复，对细胞活性具有保护性作用。

细胞内线粒体基因组(线粒体DNA) 突变率可以很好反映皮肤中UVA的累积损伤，因为该比例与年龄无关，而与皮肤光老化的程度有关[19]。UVA诱导的细胞凋亡是一个复杂事件，人体皮肤通过细胞凋亡来消除光损伤细胞，涉及不同的途径。其中的细胞色素C释放和Caspase激活的生物化学通路，主要在细胞受到死亡受体非依赖性刺激时被激活，并有放大死亡受体通路信号的作用，而紫外线辐射就属于这类刺激。该通路中，Caspase蛋白家族的级联激活起着重要作用，Caspase激活是凋亡发生的关键环节之一[20-21]。生理状态下，Caspase家族在胞质中以酶原形式存在。UVA辐射通过某些途径促使线粒体释放细胞色素C等促凋亡因子，促使Caspase-9与其结合形成凋亡小体，Caspasde-9被激活后，引起Caspase-3的激活，从而诱导细胞凋亡。Caspase-3作为Caspase家族成员中执行细胞凋亡的关键酶之一，是细胞凋亡的中枢效应器[22]。又有研究证实，线粒体通路激活的标志性蛋白就是Caspase-3，多种刺激因素的启动信号均可激活Caspase-3，然后裂解多种蛋白，阻止DNA复制和细胞修复破坏细胞核整体结构，最终导致细胞凋亡。因此，Caspase-3活化程度可作为判断细胞凋亡严重性的可靠指标之一[23-24]。

本研究发现，UVA模型组HSF细胞中Caspase-3基因和蛋白表达都上升，提示UVA刺激HSF细胞后，在细胞信号转导的级联反应中，Caspase-3被活化，从而启动下游凋亡信号，可引起细胞凋亡现象发生。但当加入抗氧化剂Gyp后，各组光老化模型细胞中Caspase-3基因和蛋白表达下调，即Gyp下调了由该通路发生的DNA转录水平，提示Gyp作为功效良好的抗氧化剂，可以拮抗紫外线诱导的光老化HSF细胞的氧化应激反应，缓解细胞遭受不利因素的刺激强度，最终减轻光老化损伤程度、减少细胞凋亡的发生，起到对HSF细胞抵抗紫外线损伤的保护作用。其作用机制包括抑制细胞内活性氧的过量生成，也包括抑制与细胞凋亡相关的Caspase家族信号通路的活性，最终减轻UVA诱导的HSF细胞光老化现象，提示绞股蓝对光老化HSF细胞有一定保护作用。

1 Kern PA,Ranganathan S,Li C,et al.Adipose tissue tumor necrosis factor and interleukin-6 expression in human obesity and insulin resistance [J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2001,280(5):E745-751.

2 Pustisek N,Situm M.UV-radiation,apoptosis and skin [J].Coll Antropol，2011,35(Suppl 2):339-341.

3 胡野，凌志强.细胞凋亡与分子医学[M].北京：军事医学科学出版社，2002：20-21.

4 Zhou BR,Yin HB,Xu Y,et al.Baicalin protects human skin fibroblasts from ultraviolet A radiation-induced oxidative damage and apoptosis[J].Free Radic Res，2012,46(12):1458-1471.

5 Kulms D,Pöppelmann B,Yarosh D,et al.Nuclear and cell membrane effects contribute independently to the induction of apoptosis in human cells exposed to UVB radiation [J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(14):7974-7979.

6 杨靓.绞股蓝总皂苷诱导小鼠白血病L1210细胞凋亡及机制探讨[D].西安：陕西师范大学，2011.

7 黄梅，王学军，杨凯.中药抗氧化成分及抗氧化活性的体外评价方法[J].重庆科技学院学报：自然科学版，2006，8(3)：109-112.

8 陶冶，张小卿，马贤德，等.绞股蓝总皂苷含药血清对光老化HaCaT细胞NF-κB通路的影响[J].安徽医科大学学报，2012，47(10)：1178-1181.

9 李薇.长波紫外线对人角质形成细胞和成纤维细胞的形态、数目及诱导型一氧化氮合酶表达的影响[D].长沙:中南大学,2007.

10 刘宁.美容中医学[M].北京：人民卫生出版社，2010：329-334.

11 李楠，谷继卜，曲桂霞.绞股蓝水煎剂对老龄小鼠SOD和LPO的抗衰老研究[J].黑龙江医药科学，2012，35(4)：41.

12 李杰，杨舟，詹琤琤.绞股蓝化学成分与药理作用研究概况[J].湖北中医杂志，2012，34(10)：74-76.

13 苏齐鉴，梁飞立，李益忠，等.绞股蓝总甙片联合山楂精降脂片治疗高效抗逆转录病毒治疗后血脂异常的疗效研究[J].中国全科医学，2012，15(11)：3903.

14 吴景东.绞股蓝抗皮肤光老化的实验研究[D].沈阳：辽宁中医药大学，2006.

15 Tang S,Lucius R,Wenck H,et al.UV-mediated downregulation of the endocytic collagen receptor,Endo180,contributes to accumulation of extracellular collagen fragments in photoaged skin[J].J Dermatol Sci,2013,70(1):42-48.

16 Valencia A,Kochevar IE.Nox1-based NADPH oxidase is the major source of UVA-induced reactive oxygen species in human keratinocytes [J].J Invest Dermatol,2008,128(1):214-222.

17 Dwivedi N,Flora SJ.Concomitant exposure to arsenic and organophosphates on tissue oxidative stress in rats [J].Food Chem Toxicol，2011，49(5)：1152-1159.

18 Bossi O,Gartsbein M,Leitges M,et al.UV irradiation increases ROS production via PKCdelta signaling in primary murine fibroblasts[J].J Cell Biochem，2008,105(1):194-207.

19 Brirch-Machin MA.Tindall M,Turner R,et al.Mitochondrial DNA deletions in human skin reflect photo- rather than chronologic aging [J].J Invest Dermatol,1998，110(2):149-152.

20 薛书霞，张景华，李景武,等.P53、Caspase-3和凋亡调节蛋白FasL在乳腺癌的表达及其意义[J].海南医学院学报，2011，18(1)：21-23.

21 蒋令修，王金兰，娄季宇,等.硫酸镁对实验性脑出血大鼠细胞凋亡及Caspase-3表达的影响[J].疑难病杂志，2012，11(2)：120.

22 Earnshaw WC,Martins LM,Kaufmann SH,et al.Mammalian caspased:structure,activation,substrates,and functions during apoptosis [J].Annu Rev Biochem,1999,68:383-424.

23 Wang XH，Zhang L，Mitch WE,et al.Caspase-3 cleaves specific 19 S proteasome subunits in skeletal muscle stimulating proteaseme activity [J].Biol Chem，2010，285(28):21249-21257.

24 李里，宫亮，吴玉斌.增殖细胞核抗原和caspase-3在单侧输尿管梗阻大鼠模型中的表达及其意义[J].中国全科医学，2012，15(10)：3489.