2009年至2013年萍乡市流感病例样本real-time RT-PCR结果分析

邓兰，李晶鑫，钟知情，张春芝，谢荣福，朱金华

(1、萍乡市疾病预防控制中心，江西萍乡337000；2、江西中医药大学，江西南昌330004)

2009年至2013年萍乡市流感病例样本real-time RT-PCR结果分析

邓兰1，李晶鑫1，钟知情1，张春芝1，谢荣福1，朱金华2

(1、萍乡市疾病预防控制中心，江西萍乡337000；2、江西中医药大学，江西南昌330004)

目的通过对萍乡市历年流感样病例的病毒核酸检测结果分析，了解当地流感疫情状况，分析当地流感发病趋势，为预防和控制流感流行提供科学论证凭据。方法萍乡市人民医院为国家流感样病例监测哨点医院，对符合流感样病例定义的病例收集相关信息，采集咽拭子标本，采用实时荧光逆转录聚合酶链反应法(real-time RT-PCR)对标本进行流感病毒核酸检测，并进行统计分析。结果萍乡市流感病毒核酸阳性率22.09%，其中2009年阳性率59.75%最高，之后呈下降趋势。新甲型H1N1流感病毒和乙型流感病毒阳性数接近，构成比分为33.74%和30.89%。新甲型H1N1共检出阳性166例，其中2009年9-12月检出阳性143例，2009年11月为最高峰，阳性率达到(75/143)52.45%，2010年以后有少量病例发现。乙型和季H3流感检出阳性数逐年增加。男、女流感核酸阳性检出率分别为23.19%(291/1255)和20.68%(201/972)。年龄分5个组统计分析，阳性率分别是37.25%、30.59%、19.40%、18.69%和13.00%。结论萍乡市流感病例核酸阳性以新甲型H1N1和乙型为主；季H3流感病例核酸阳性有所增加，且新甲型H1N1在2009年12月后得到有效控制，流感病毒易感染人群以学龄儿童和青少年为主，性别无差异。

流感病毒；实时荧光逆转录聚合酶链反应法；病毒分型

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，俗称流感。由于其经呼吸道飞沫传播，传播迅速，加之其病毒抗原易发生变异，因而人群对变异株普遍易感，防控难度大，易发生暴发流行。患者临床表现为发热体温≥38℃，并伴有咳嗽、流鼻涕、全身酸痛等体征[1]。萍乡市于2009年9月建成流感病毒核酸检测实验室，并参与了国家流感网络实验室流感应急检测，从2009年9月至2013年12月，本实验室共采集了可疑流感病例的呼吸道咽拭子标本2227份进行流感病毒核酸检测，现将检测结果分析如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 资料来源和采集2009年9月至2013年12月，萍乡市人民医院接诊的可疑流感病例，患者体温≥38℃，伴咳嗽、流涕、全身酸痛等症状，且3d内未服用任何抗病毒药物。采集的样品类型为鼻咽拭子，送检途中冷藏。

1.1.2 仪器美国Promega Maxwell 16RAutomated Purification Instrument[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]，ABI7300 real-time RT-PCR仪(美国应用生物系统公司)；干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司，型号：K30)；漩涡震荡仪(德国IKA MS 3 basic)；高速离心机(型号：PICO 21)，生物安全柜(均为赛默飞世尔科技公司)。

1.1.3 试剂Promega Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purfication Kit[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]；real-time RT-PCR试剂(中山大学达安基因股份有限公司)：甲型流感病毒核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法，货号：#DA-BN094)，乙型流感病毒核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法，货号：#DA-BN095)，人流感病毒H3亚型核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法，货号：#DA-BN144)，新甲型H1N1流感病毒(2009)RNA检测试剂盒(PCR荧光探针法，货号：#DA-BN093)等。

1.2 方法

1.2.1 生物安全所有实验过程均在生物安全二级(BSL-2)安全实验室中进行。

1.2.2 实验过程先将标本经充分振荡混匀，严格按照所有试剂说明书要求进行操作。

1.2.3 质量控制严格执行标准操作程序(SOP)，每次实验均设立内部质控，阴性对照(NTC)和阳性对照(PTC)。

1.2.4 统计学方法SPSS13.0(for windows)软件包分析统计，率的比较采样χ2检验，以P＜0.0.5为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 流感病毒核酸阳性分型及时间分布2009年9月至2013年12月共检测疑似标本2227例，检出流感病毒核酸阳性492例，阳性率22.09%，其中以2009年阳性率59.75%为最高，逐年下降。流感病毒核酸分型检测出新甲型H1N1、乙型和季节性H3阳性三种，无季节性H1，其中新甲型H1N1流感病毒阳性数166例，乙型流感病毒阳性数152例，两者相接近，构成比分别为33.74%和30.89%。新甲型H1N1共检出阳性166(33.74%)例，其中2009年9月至12月检出阳性143份，2009年11月为最高峰，阳性率达到(75/143)52.45%，2010年以后有少量病例发现。乙型和季H3流感检出阳性数逐年增加，2012年和2013年流感病毒核酸阳性主要是以乙型和季H3为主。结果见表1和表2。

表1 流感病毒核酸检测结果

表2 流感病毒核酸阳性分型统计表[n(%)]

2.2 流感病毒核酸阳性性别及年龄分布男、女分别检测1255例和972例，检出流感病毒核酸阳性分别为23.19%和20.68%，χ2=2.0，P＞0.05无显著性差异，结果见表3。年龄分5个组统计分析，阳性率分别是37.25%、30.59%、19.40%、18.69%和13.00%。统计学处理，P＜0.05，不同年龄核酸检测阳性率有显著差异，以学龄儿童和青少年为阳性率最高。结果见表3、表4。

表3 不同性别人群流感病毒核酸检测阳性统计表

表4 不同年龄流感病毒核酸阳性分型统计表[n(%)]

3 讨论

real-time RT-PCR是国内外新建立的一套快速准确的诊断技术，其原理是：在PCR反应体系中加入荧光标记的寡核苷酸探针，在逆转录和PCR扩增后，通过对荧光进行测定来对扩增产物进行定量分析，该方法具有特异性强、自动化程度高等特点，可有效解决PCR污染问题[2]，并且操作简单，灵敏度高。从核酸的提取到病毒的检测，全程仅需3～4h，大大缩短了病毒的检测周期，为流感的防控提供了及时可靠的实验室依据，还能针对不同亚型检测，它对流感暴发的防治和监测具有非常重要的作用。本实验室现阶段使用real-time RT-PCR法检测流感病毒，其结果为最终的确诊结果[3]。

萍乡市近五年的流感病毒核酸检测结果显示，萍乡市流感病毒优势株为新甲型H1N1流感毒株和乙型流感毒株。在2009年9月至12月，检出的流感毒株主要为新甲型H1N1流感毒株，阳性数为143份(75.26%)，2009年11月为阳性检出数高峰期，阳性率达到(75/143)52.45%；2010年以后有少量病例发现，其流行趋势与我国南方部分地区相似[4]，且新甲型H1N1在2009年12月后得到有效控制。乙型流感病毒和季节性H3流感病毒检出阳性数呈逐年增加，2012年和2013年流感病毒核酸阳性主要是以乙型流感和季节性H3流感为主。萍乡市近五年的流感核酸检测结果分析还显示流感病毒核酸阳性病例与性别无差异，这一结果与文献报道的我国其他地区一致[5]。流感病毒核酸阳性年龄分布以15～24岁组最高(37.25%)，其次为5～14岁组(30.59%)，新甲型H1N1阳性也是以15～24岁组最高(19.43%)最高。提示萍乡市流感病毒的易感人群是学龄儿童和青少年，在今后流感的防控应重点放在学龄儿童和青少年中，加强对该人群的健康教育，提高其自我防护意识，并做好流感疫苗为主导的综合性预防措施[6]。

[1]董晓毅,孙长贵.H7N9禽流感病毒感染及其实验室诊断[J].实验与检验医学,2013,31(2):105-107.

[2]穆晞惠.荧光定量PCR技术及其在生物检测中的应用[J].齐齐哈尔医学院学报,2006,27(23):1227-1229.

[3]穆煜,于俊峰,常晓,等.快速甲型/乙型流感抗原筛查试验与H1N1 PCR检测结果的比较与评价[J].实验与检验医学,2010，28(2): 105-106.

[4]罗燕,周爱华,黎冠,等.邵阳市2009年流感流行病毒核酸检测结果分析[J].实用预防医学,2010,17(12):2512-2513.

[5]高洁,韩亦菲,李妹霖,等.2009-2011年汉中地区甲型流感检测分析[J].现代检验医学杂志,2012,27(2):125-127.

[6]周珺,邹明霞,熊英,等.2007年江西省甲3亚型流感毒株HA1基因特性的分析[J].实验与检验医学,2008,26(6):613-614.

Analysis of real-time RT-PCR detection for influenza samples from 2009 to 2013 in Pingxiang city

DENG Lan,LI Jingxin, ZHONG Zhiqing,et al.Center for Disease Control and Prevention of Pingxiang City,Jiangxi Pingxiang 33700,China.

Objective To analyze the data from surveillance of influenza virus in Pingxiang city over the years and to explore the epidemic situation of influenza and incidence trend of influenza so as to provide scientific evidence for prevention and control of influenza credentials.Methods The relevant informations and throat swab specimens were collected from influenza-like patients at the Pingxiang City People's Hospital，which is a national influenza surveillance hospital.The influenza virus nucleic acid was detected by using real-time RT-PCR method and statistical analysis was performed.Results In Pingxiang city,the positive rate of nucleic acid of influenza virus was 22.09%,but in 2009 the positive rate was 59.75%，which was the highest and then declining year by year.The positive rates of new influenza A(H1N1)virus and influenza B virus were close,which were 33.74%and 30.89%respectively.166 samples were positive for new influenza A(H1N1),of which 143 samples were positive from September to December in 2009,the highest peak in November 2009,the positive rate was(75/143)52.45%,a small number of cases was detected after 2010.The positive rate of B influenza and H3 influenza were increasing year by year.The positive rate in male were 23.19%(291/1255)and 20.68%(201/972)in female respectively.Conducting statistical analysis according to the age of five groups,the positive rate was 37.25%,30.59%,19.40%,18.69%and 13.00%,respectively.Conclusions In Pingxiang influenza virus was mainly new influenza A(H1N1)and B influenza.The H3 influenza was increasing,but the new influenza A(H1N1)was effectively controlled after December 2009.The population susceptible to influenza virus was mainly school children and teenagers, there was no gender differences.

Key words：Influenza virus；Real-time reverse-transcription polymerase chain reaction；Virus genotyping

R373.1+3

A

1674-1129(2014)05-0511-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.05.007

2014-07-24；

2014-08-10)

邓兰，女，1977年6月生，本科，主管技师，主要从事与疾病预防工作有关的检验工作。

朱金华，男，1977年1月生，硕士，高级实验师，主要从事中医药与病原生物学研究工作。