茶多糖对LPS活化单核巨噬细胞内活性氧的影响

王长文，马洪波，张 铎，赵文秀

（1.吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院检验学院，吉林 吉林 132013；3.吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013）

我国产茶区分布广，茶叶品种丰富，但对茶的成分和功效影响最大的是茶叶发酵程度。与非发酵茶比较，属于发酵茶的红茶糖类含量相对高，组成与结构稳定[1]。茶多糖是由多种单糖和糖基组成，体外研究表明，茶多糖对物理和化学来源的活性氧(reactive oxygen species，ROS）具有清除作用。细菌等微生物感染后，单核巨噬细胞、嗜中性粒细胞在细菌内毒素等刺激下，可产生大量ROS[2]。炎症反应中免疫细胞内过量的ROS可破坏胞内的脂质、蛋白及细胞器；而释放的ROS可导致肺泡和血管内皮等组织细胞的损伤[3]。茶多糖是否可调节LPS活化单核巨噬细胞内ROS水平还未见报道，本研究将以单核细胞系的U937细胞为模型，分析茶多糖对ROS的影响。

1 材料与方法

1.1 试验细胞 U937引自美国标准生物品收藏中心（American type culture collection，ATCC），液氮中冻存。

1.2 试验药品 细菌脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS），购自国家标准物质中心。异硫氰酸荧光素(fluo⁃rescein isothiocyanate，FITC），购自Sigma公司(美国）。活性氧探针双氯荧光黄乙酸乙酯（Dichlorofluo⁃rescin diacetate，DCFH-DA），购自碧云天生物技术公司。Annexin-V和PI双染凋亡检测试剂盒，购自eBioscinedce公司(美国）。

1.3 试验仪器 流式细胞仪为EPICS-XL型（美国贝克曼公司）。

1.4 茶多糖的提取、纯化和标记 以福建“正山小种”红茶为原料，水浸泡的方式提取茶多糖，大孔树脂层析法制备纯化的红茶多糖(black tea polysac⁃charides，bTPS）。并采用酪胺还原法标记异硫氰酸荧 光 素(fluorescinisothiocyate，FITC），制 备 FITC-bTPS。将bTPS和FITC-bTPS（按bTPS计算）溶于PBS，配制为2mg/mL的储存液，分装后-20℃保存。1.5 细胞培养和干预 复苏U937细胞，以含10%小牛血清的1640培养液在37℃、5%CO2和饱和湿度下培养。将细胞用培养液调为3×105/mL，按3mL孔接种于6孔板，加入不同浓度FITC-bTPS（0、10、20μg/mL和40μg/mL），继续培养2 h后，收集细胞后通过检测FITC的荧光分析bTPS与细胞的结合；用LPS（20 μg/mL）和FITC-bTPS（0、10、20 μg/mL和40μg/mL）同时处理细胞2 h，收集细胞后分析bTPS与细胞的结合。接种细胞，加入不同浓度的LPS（0、10、20μg/mL和40μg/mL），继续培养4 h后，检测细胞内ROS。用LPS（0 μg/mL和20μg/mL）处理和bTPS（0μg/mL和20μg/mL）处理细胞4 h，分析细胞内ROS和水平；并分析细胞凋亡。

1.6 细胞内活性氧检测 收集细胞，用PBS调为密度2×106mL的细胞悬液，取500μL细胞悬液，加入DCFH-DA储存液，至其终浓度为5μmol/L，混匀后在37℃避光反应30min，PBS洗2次后用流式细胞仪分析。

1.7 细胞凋亡分析 将细胞用PBS洗涤2次，用结合缓冲液调为2×106/mL的细胞悬液。取190μL细胞悬液，加入10μL FITC-标记Annexin-V，室温下避光反应15min；离心弃上清，加入结合缓冲液500 μL，再次洗涤后，475μL结合缓冲液重悬细胞，接入PI溶液25μL，混匀后立即用流式细胞仪分析。

2 结果与分析

2.1 茶多糖与LPS竞争结合U937细胞 流式细胞术分析表明，FITC-bTPS可与U937细胞结合，荧光强度的均值代表细胞膜表面结合FITC-bTPS的相对量。与空白对照组比较（图1A），相同处理时间，荧光强度均值伴茶多糖浓度增加而增加（图1B～E）。来自植物、动物和微生物的多糖可与细胞膜的Toll样受体家族结合，主要是TLT2、TLR4和TLR7等，即它们在细胞膜表面有共同的受体。为研究茶多糖是否与LPS竞争结合U937表面的受体，将20μg/mL的LPS和不同浓度的FITC-bTPS（0、10、20μg/mL和40μg/mL）同时处理细胞，分析荧光强度。LPS同时处理条件下，FITC荧光强度仍以浓度依赖的方式增加，但显著低于FITC-bTPS单独作用组（图F～I）。该结果表明，茶多糖和LPS可竞争与U937细胞结合，提示两者有共同的受体。

图1 茶多糖与LPS竞争结合U937细胞

2.2 茶多糖和LPS对U937细胞ROS的影响 单核细胞、嗜中性粒细胞表面与LPS结合的主要是TLR4，LPS与TLR4结合可诱导细胞活化、细胞内活性氧增加。DCFH-DA进入细胞后被酯酶水解为DCFH，该物质被氧化后生成DCF，而DCF发射的荧光可采用流式细胞仪525 nm通道(FL1）来检测,其荧光强度值代表细胞内ROS水平。我们发现，U937细胞内的ROS随LPS浓度增加而增加（图2A～D）。不同浓度未标记的茶多糖（bTPS）与20μg/mL的LPS处理细胞后，LPS所激发的ROS水平逐渐随bTPS浓度增加而减少（图2E～H）。该研究结果提示，茶多糖可能通过与LPS竞争结合U937细胞而降低细胞内过量ROS的产生。

图2 茶多糖和LPS对U937细胞ROS的影响

2.3 茶多糖和LPS对U937细胞凋亡的影响 过量的ROS可使细胞发生凋亡、坏死和自噬等改变，导致组织损伤。为分析茶多糖对LPS诱导的细胞凋亡是否有影响，采用Annexin-V和PI双染法检测茶多糖和LPS处理后U937细胞亡的情况。与对照组比较（图3A），20μg/mL的LPS可导致细胞发生早期凋亡、晚期凋亡和坏死（图3B）；20μg/mL茶多糖处理后，细胞无显著凋亡和坏死（图3C）；与LPS单独处理组比较，两者共同作用组晚期凋亡和坏死细胞显著减少（图3D）。

图3 茶多糖和LPS对U937细胞凋亡的影响

3 讨论

研究表明，茶多糖具有多种生物活性，日常饮茶或摄入茶多糖有助于延缓衰老、预防心血管疾病和预防辐射损伤[4-5]。茶多糖成为茶叶中极具开发利用价值的生物活性物质，有必要深入了解其作用机制，以推动其应用。本研究证实发酵茶多糖可与单核细胞结合，并揭示了茶多糖可与LPS竞争结合细胞膜表面受体。在细菌内毒素刺激下，免疫细胞活化后产生ROS而杀伤细菌,是机体抗感染免疫的一种效应。但大量研究表明，过量的ROS导致感染后免疫细胞自身凋亡、坏死，并通过释放游离的氧自由基，还导致组织损伤、细胞纤维化[6]。长期慢性的感染，炎症反应所释放的自由基还参与基因突变、诱发细胞癌变的过程。茶多糖具有抗氧化活性，但对其机制的深入研究较少，多限与其消除物理、化学法诱发ROS的炎症。本研究结果提示，茶多糖可与LPS竞争结合单核细胞，从而降低细胞内ROS的水平，并减少LPS所导致的细胞凋亡和坏死。茶多糖消除ROS的机制涉及多方面，包括其还原性多糖直接消除ROS等，全面了解茶多糖消除ROS的机制还需要深入研究。

[1] 谢明勇，聂少平.茶叶多糖的研究进展[J].食品与生物技术学报，2006，25(2）:107-114.

[2] 黄利，夏鸿，伦玉宁，等.细菌内毒素体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮实验模型的条件[J].南方医科大学学报，2012，32(11）:1646-1650.

[3] 刘静，张向阳.血管内皮细胞损伤与修复的机制的研究进展[J].新疆医科大学学报，2009，32(9）:1385-1387.

[4] 沈健，陈增良，沈香娣，等.茶多糖抗肿瘤及其增强免疫作用的研究[J].浙江预防医学，2007，19(8）:10-12.

[5]毛华，楚慧丽，刘月冉，等.免疫细胞多糖受体及其研究方法[J].食品与药品，2011，13(3）:136-138.

[6] 樊军，刘毅.细胞凋亡与低氧性肺损伤的研究进展[J].临床军医杂志，2007，35(4）:617-620.