刺槐胚性细胞悬浮体系的建立1)

冯 玥 习 洋 陈 串 喻娃亚雄 王少明 徐惠敏 孙宇涵 李 云

(北京林业大学，北京，100083) (国有洛宁县吕村林场) (北京林业大学)

刺槐(Robinia pseudoacacia L.)又名洋槐，属豆科刺槐属的落叶乔木。天然分布于美国东部，并于1877—1878年被首次引种至我国南京，1898年被大范围引种至青岛种植，如今，刺槐在我国已成为一种重要的生态树种而被广泛种植［1］。刺槐生长迅速，木材坚韧、纹理细致、有弹性、耐水湿、抗腐朽，是重要的速生用材树种。刺槐长有大量根瘤，可以通过其根中的瘤菌固氮增加土壤肥力，在提高林分质量、维持生态平衡等方面发挥重要作用［2］。刺槐的叶片含有大量粗蛋白，是优质廉价的家畜饲料资源［3］。刺槐花营养丰富，是人们熟悉的蜜源花，还可用于提取香料等［4］。综上可知，刺槐具有极高的环境和经济价值。关于刺槐的离体培养研究始于20 世纪50年代末，80年代以后达到高潮［5］。目前，刺槐通过形成层培养、茎培养、叶片培养、未授粉子房的培养等已获得了完整的植株，但这些研究都集中在器官发生途径，通过体细胞胚发生及原生质体培养等途径的研究却很少。

植物细胞悬浮培养技术是20 世纪80年代之后发展起来的重要的细胞离体培养技术。由于其分散性好，细胞或细胞团大小均匀，生长迅速，细胞状态可以相对保持一致，易于调控等［6］，被广泛用于遗传学、生理学、细胞学、生物化学、发育生物学及分子生物学等多个领域的研究。细胞悬浮培养不仅可以直接用于原生质体分离和培养、细胞杂交、基因转移、次生代谢产物的生产等，还可以在细胞水平筛选突变体，因此，细胞悬浮培养已成为生物技术研究开发的新热点，并被广泛应用于植物新品种的培育［7］。

目前，已建立完善的悬浮细胞培养系的木本植物主要有龙眼、红豆杉、枸杞等，关于刺槐细胞悬浮培养的研究国内尚未见报道，而建立起优质、快速生长的刺槐胚性细胞悬浮系，可为进一步研究刺槐原生质体培养及体细胞杂交、体细胞胚同步化的研究提供良好的试验材料。本研究以刺槐胚性愈伤组织为材料，利用正交试验的方法研究了外植体取材时期、基本培养基、细胞起始密度、2，4－D 质量浓度对悬浮细胞的影响，并建立了刺槐胚性细胞悬浮系，以期为刺槐细胞培养的相关研究奠定基础。

1 材料与方法

以北京市延庆米家堡苗圃生长良好的二倍体刺槐实生苗群体为取材资源，选取5 棵生长良好、干型较直、结实率高的成年母树(间隔大于50 m)，在7—8月间，采集开花后45、55、65、75 d 的刺槐不同发育阶段的合子胚作为外植体试验材料，每间隔10 d 采集1 次，每次采集500 个荚果。将当天采集的荚果用塑料密封袋密封放入冰盒中带回实验室，之后放在冰箱中在4 ℃温度条件下冷藏备用，1 周内接种。

1.1 愈伤组织的诱导与增殖培养

将采集的荚果用水洗净，从中取出未成熟的种子，在超净工作台上用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3 次，0.1% HgCl2浸泡5 min，无菌水冲洗5 ～6次。在无菌条件下，将未成熟的合子胚从荚果中取出，接种到MS+MES 500 mg·L－1+蔗糖30 g·L－1+0.6%琼脂+2，4－D 5.0 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1愈伤组织的诱导培养基上，诱导发生胚性愈伤组织［8］。30 d 继代1 次，每次继代时，注意挑选嫩黄绿色、松散易碎、颗粒状的愈伤组织进行继代培养。

1.2 悬浮培养系的建立

选择嫩黄绿色、颗粒状、生长较快的胚性愈伤组织，用无菌镊子轻轻夹散，放入盛有30 mL 液体培养基的150 mL 三角瓶内，置于水平旋转摇床上振荡培养。接种量分别为1.0、2.0 ～3.0、3.0 ～4.0 g，培养条件为(25 ±1)℃，黑暗，120 r/min 振荡培养。每隔7 d 继代1 次，前2 次继代时，弃去上清液约2/3，补以等量的新鲜培养基;从第3 次继代开始，将培养物过60 目的细胞筛，将筛上的胚性愈伤组织重新悬浮于新鲜的培养基中。连续培养5 ～6 代后，得到分散度较好、稳定性较强且具有胚性的悬浮培养细胞。悬浮培养的培养基成分见表1。

表1 悬浮培养基成分

1.3 悬浮系质量及其培养物胚性的鉴定

使用精密pH 试纸测定悬浮系的pH 值，并观察悬浮系是否澄清，有无褐化现象，静止过夜，观察悬浮系是否清晰分层等。将悬浮系摇匀，每瓶取2 mL悬浮液，放置在10 000 r/min 的离心机中离心5 min，并弃去上层液体，称量固体质量。使用SPSS 17.0 进行数据分析，每个水平设5 个样本，每个处理3 个重复。

用吸管吸取悬浮液，将其均匀的接种于表面垫有滤纸的MS+MES 500 mg·L－1+蔗糖30 g·L－1+0.6%琼脂+2，4－D 5.0 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1固体愈伤组织的诱导培养基上，进行看护培养。每14 d 继代1 次，培养4 周后将培养物接种到MS+MES 500 mg·L－1+蔗糖30 g·L－1+0.6%琼脂+NAA 0.5 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1+谷氨酰胺250 mg·L－1+水解酪蛋白500 mg·L－1固体体细胞胚诱导培养基上，观察经悬浮培养得到的单个细胞是否可在固体培养基上增殖产生胚性细胞团。

2 结果与分析

2.1 胚性愈伤组织的继代培养与胚性保持

在刺槐胚性愈伤组织的继代过程中，我们发现，外植体的胚龄对愈伤组织胚性的保持影响很大，随着外植体胚龄的增大，诱导得到的愈伤组织胚性保持能力逐渐下降，以授粉后55 d 的未成熟合子胚为最佳。授粉后45 d 的外植体因其较为幼嫩，愈伤诱导率约为71%，为4 组外植体中最低，其诱导得到的愈伤组织多为白色透明、生长极为迅速且质地蓬松的非胚性愈伤组织。经过3 ～4 次继代培养，部分愈伤组织转化为嫩黄绿色、颗粒状的胚性愈伤组织，但这部分愈伤组织并不稳定，随着继代次数的增多，这部分转化得到的胚性愈伤组织逐渐变成乳白色、生长缓慢、含水量极高的棉花状愈伤组织，见图1－A。授粉后65 d 和75 d 的外植体胚性愈伤诱导率分别为84.32%与77.13%，因其接近成熟，在诱导愈伤组织时会出现直接发芽的情况，得到的愈伤组织，其胚性保持也较为困难，经过3 ～4 次继代培养，大部分胚性愈伤组织会出现不同程度的褐化现象，见图1－B。试验中，以授粉后55 d 的未成熟合子胚为外植体胚性愈伤组织的诱导率最高，其愈伤诱导发生率达93.20%，且经过多次继代，愈伤组织胚性没有出现明显的下降，且依然保持旺盛的生长力，见图1－C。因此，授粉后55 d 的未成熟合子胚是为刺槐细胞悬浮培养提供胚性愈伤组织的最佳起始材料。

2.2 刺槐悬浮培养系的建立

2.2.1 基本培养基对悬浮系建立的影响

在悬浮系建立的过程中发现，1/2MS 比MS 对悬浮系的建立更为有效。以授粉后55 d 的刺槐未成熟合子胚为外植体诱导得到的胚性愈伤组织为起始材料，接种于MS 液体培养基的愈伤组织悬浮起来较困难，细胞分散性差，颗粒较大，一般在5 mm以上，将培养物轻摇发现培养系液体部分较为澄清，见图1－D。此细胞悬浮系中细胞生长速度缓慢，经过3 次继代后容易出现褐化现象，平均每4 瓶中即有1 瓶发生严重褐化。且经过过筛处理后悬浮物状态变差，部分细胞破碎且胚性降低，见图1－E。而接种于1/2MS 液体培养基的愈伤组织悬浮起来较容易，细胞分散性良好，生长迅速，且在继代过程中不易出现褐化现象，过筛处理后细胞分散均匀，长势良好，见图1－F。因此，为快速建立刺槐细胞悬浮培养系，应采用1/2MS 作为基本培养基。

图1 刺槐的胚性愈伤组织及其悬浮系建立

2.2.2 植物生长调节剂种类和质量浓度水平对细胞悬浮系建立及维持的影响

以授粉后55 d 的刺槐未成熟合子胚为外植体诱导得到的胚性愈伤组织为起始材料，1/2MS 为基本培养基，本试验研究了植物生长调节剂种类和水平对悬浮系建立及维持的影响，见表2。试验中，我们发现诱导胚性愈伤组织的激素种类和激素质量浓度并不适用于刺槐细胞悬浮培养，当培养基中附加的植物生长调节剂为2，4－D 5.0 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1时，此植物生长调节剂组合条件下悬浮细胞培养物的鲜质量增长最为缓慢，见图2。且有许多月牙形、长条形等不规则形状的细胞出现(如图3－B)，这类细胞的细胞质稀薄，生长缓慢，所得到的细胞悬浮液密度最低。可见高质量浓度的生长素不利于刺槐悬浮细胞的增殖。在附加了较低质量浓度的生长素NAA 的培养基中，细胞增殖速度明显加快，且细胞密度显著高于附加2，4－D 的激素组合，因此，悬浮培养时，NAA 较2，4－D 更利于刺槐细胞的增殖和生长力的保持。当培养基中附加激素为NAA 2.5 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1时，培养液中的细胞多为球形和近球形的细胞或细胞团，细胞质浓厚，具有丰富的颗粒状内含物，生长力旺盛，见图3－A。试验发现，1/2MS +NAA 2.5 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1为刺槐细胞悬浮培养的最适培养基。

表2 以1/2MS 作为基本培养基的悬浮系的生长调节剂组合及其质量浓度水平

图2 植物生长调节剂组合对细胞悬浮培养的影响

经过3 周的振荡培养，悬浮细胞生长可达到最佳状态，该悬浮系中的胚性细胞团均匀，生长旺盛，呈淡黄色，分散度高，无褐化现象。在显微镜下以可直接观察到:细胞团有几个至十几个细胞组成，细胞碎片少且细胞质浓厚，见图3－C。

图3 刺槐的胚性细胞与非胚性细胞

2.2.3 细胞悬浮培养液中pH 值的变化

如图4所示，在生长周期内，各起始浓度的悬浮系pH 值均呈现波状变化动态，结合刺槐悬浮系细胞生长曲线(图4)可发现，培养液的pH 值变化与细胞生长速率有一定的相关性，当培养初始阶段培养液pH 值发生显著降低时，细胞的生长处于相对缓慢状态，当培养液pH 值回升时，细胞开始进入对数生长期，培养液最适的pH 值范围在5.0 ～5.7。

图4 细胞悬浮培养物pH 值的变化

在培养的前7 d，悬浮系的pH 值先下降后上升，之后随着被培养物质量浓度的增加，pH 值又略微下降。Amino 和Tazawa 曾报道(1998)，在水稻悬浮细胞中早期蔗糖的快速水解会导致培养液的pH值迅速下降，与本试验结果相符。

2.2.4 悬浮细胞培养系的细胞起始密度与生长速率之间的相互关系

悬浮细胞的生长速率与初始接种时的细胞密度有很大关系，如果接种密度低于最适密度时，细胞生长速度缓慢或不生长;如果接种密度过高，会造成细胞的对数生长期缩短，悬浮培养物的生长速度早早降低或停止生长［9］。因此，确定适宜的细胞起始密度是快速建立胚性悬浮系的关键。

由图5可知，不同起始干质量的培养体系中的细胞干质量都随着培养时间的延长有不同程度的增长。从细胞干质量曲线可以看出，起始干质量为2.0 g 的悬浮系统其生长量增速较快，且细胞保持持续增长;当起始干质量为3.0 g 时，培养16 d 后细胞进入缓慢增长期，且生长量有回落的趋势，可见起始干质量过高会造成悬浮系的培养周期缩短。分析原因可能是悬浮系中培养物过多，细胞密度过大，细胞出现饥饿状态，且分泌出某些有毒物质抑制细胞的生长，部分细胞解体死亡。起始干质量为1.0 g 时，细胞增殖速度非常缓慢，且容易出现褐化死亡的现象。当培养时间超过20 d 后，随着培养时间的延长，悬浮系产生褐化的趋势增加，活细胞率迅速降低，且因继代次数过多而极易发生大规模染菌。

图5 刺槐悬浮细胞系生长曲线

3 结论与讨论

植物细胞悬浮培养目前已经成为植物生物技术中最有效的研究手段之一，也是植物细胞生长的微生物化途径之一［10］，细胞在培养过程中可始终保持着良好的分散状态，通过建立稳定的胚性细胞悬浮系可快速分离大量优质原生质体，促进胚性细胞大量快速增殖，形成均一的小细胞团和单细胞，为生理生化、遗传和细胞学等研究提供良好的试验体系。本试验通过对刺槐未成熟合子胚的诱导以及对胚性细胞悬浮培养条件的探索，建立了刺槐的胚性细胞悬浮培养体系。

悬浮细胞系的建立通常以生长快速的松散胚性愈伤组织为起始材料，对于培养难度较大的木本植物来说，建立悬浮细胞系成功的关键在于是否能成功诱导出松散、易碎的高品质胚性愈伤组织。吕冬霞等［11］认为，多数情况下，单独使用2，4－D 就可以成功诱导愈伤组织的发生，而红艳［11］的研究发现:在胚性愈伤组织的诱导过程中需要有高质量浓度的生长素(2，4－D，0.1 ～3.0 mg·L－1)参与，或补加适量的细胞分裂素(6－BA，0.1 ～1.0 mg·L－1)。习洋等［7］的试验则发现在2，4－D 质量浓度为0 ～5.0 mg·L－1的范围内，诱导率与2，4－D 质量浓度成正相关关系，但得到的愈伤组织继代后易褐化死亡，再生频率很低，而当高质量浓度的生长素与低质量浓度的分裂素协同作用时其效果将优于只添加生长素的培养基配方。本试验采用了高质量浓度的2，4－D 与低质量浓度的BA 配合使用的愈伤组织诱导配方，成功诱导出了大量高质量具有胚性的愈伤组织，在短时间内建立了理想的胚性细胞悬浮体系，验证了高质量浓度生长素与低质量浓度分裂素协同作用是诱导刺槐胚性愈伤组织的理想植物生长调节剂搭配方式。

悬浮细胞培养体系条件的优化是植物细胞悬浮培养研究中的重要内容之一。悬浮培养系的基本培养基中大量元素的质量浓度对悬浮培养愈伤组织细胞的存活率具有较大的影响，较高渗透压的培养基不利于悬浮系的建立。有研究表明［12］:当培养基中大量元素总质量浓度过高时，枸杞(Lycium bararum)悬浮系中活细胞百分率降低，还可看到许多细胞呈皱缩状态。梁军等［13］在印楝的悬浮系建立试验中发现:B5 较MS 对悬浮系的建立更为有效。接种在MS 培养基上的愈伤组织生长缓慢，在继代过程中易发生褐化现象;而接种到B5 培养基上的愈伤组织在培养过程中基本没有出现褐化现象，且生长迅速，继代3 次即可建立起比较均匀的悬浮培养系。本次试验也得出相似的结论，在MS 培养基与1/2MS 培养基的对照组中，接种在1/2MS 培养基上的愈伤组织更易被悬浮起来，且褐化现象明显减少。

在多数植物组织培养中，外源生长素和细胞分裂素是细胞离体培养所必需的激素。两者不同质量浓度和比例或先后配合的应用不但可诱导细胞分裂和生长、而且能控制细胞分化和形态建成［14］。根据乔琦等［15］的研究发现，降低2，4－D 的质量浓度或用作用较弱的NAA 代替，可以促进体细胞胚的分化和发育。在本次试验的悬浮系建立初期，我们发现较高质量浓度的2，4－D 不利于刺槐悬浮细胞的增殖，而在附加了调节功能相比2，4－D 较弱的生长素NAA 的培养基中，细胞增殖速度明显加快，且体系中细胞质量浓度显著增大［16－17］。故较低质量浓度的NAA 与BA 组合更有利于刺槐胚性细胞系的建立。

褐化与染菌是植物悬浮细胞系建立过程中的普遍现象，张喜春等［18］在建立软枣猕猴桃(Actinidia arguta)的悬浮系时曾发现，随着生长期增加，细胞褐化发生的时间越短。本研究所得到的悬浮系最理想培养时间为20 d，当其培养时间超过20 d 时，细胞褐化频率明显增加。且悬浮系在建立过程中需通过不断继代与滤网筛选以剔除较大的原胚及难以分散的愈伤组织，随着培养时间的增长悬浮系染菌几率也随之增大，从而导致悬浮细胞在尚保持良好胚性的状态下细胞总质量反而下降的现象出现［19－20］。

对于体细胞胚发生的调节方式，人们的了解目前仅限于对胚发育过程中的影响因子的探索及其调控手段的应用，对于单个体细胞和各细胞团块在分裂发育时不同步的作用机制至今仍缺乏了解。虽然在本次试验过程中，我们可以使体细胞胚停留于胚胎发育的某一阶段，并在一定程度上控制其大小，但对于体细胞胚的质量仍无法高效迅速地进行筛选。在今后的试验中，应结合分子手段，就体细胞胚发育不同步的内部机制，外部环境因子与其内部生理生化变化关系等方面进行更深入的研究。

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