泛素-蛋白酶体系统与心肌肥厚

张文斌 唐其柱 李 金

心肌肥厚(cardiac hypertrophy)在广义上是指由于压力负荷或者容量负荷过大导致心肌产生的代偿性的变化，包括心室壁肥厚和心室腔扩大两个方面。心肌肥厚可以分为生理性肥厚和病理性肥厚两种，生理性肥厚作为一种适应性肥厚，本文不做过多探讨。而病理性肥厚则是一种代偿性肥厚，多见于高血压、心瓣膜病、心肌疾病等心血管疾病，是心肌对心血管疾病的一种病理反应［1］。多项研究已经证明心肌肥厚是心律失常、心肌缺血等心血管疾病或并发症的独立危险因素，终末期可导致心力衰竭和恶性室性心律失常发生，也是猝死的一个危险因素［2，3］。心肌肥厚必然伴随着心肌细胞内蛋白质合成与降解的失调，即蛋白质合成增加、降解的减少或是兼有两者，因此泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)作为一个调节细胞内蛋白质的降解与功能的关键系统，在心肌肥厚的发生发展过程中起到了关键性的作用。美国心脏协会亦证实UPS是维持心脏平衡的重要条件。在细胞内，UPS途径通过消耗腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，对底物蛋白质进行高效的、高选择性的降解，哺乳动物细胞内约80%～90%的蛋白质通过这个途径被降解［4］。UPS途径在降解错误折叠的、被氧化的以及损伤的蛋白质的过程中起到至关重要的作用［5］。心肌肥厚的发生有高血压、神经内分泌因素以及生长因子和细胞因子等诸多因素的参与，但本文主要对UPS抑制剂对抗由高血压引起的心肌肥厚，尤其是左心室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVF)的机制进行阐述。

一、泛素化过程

泛素化在哺乳动物细胞内蛋白质降解的过程中起到重要作用，在调控蛋白质的活性与定位过程中扮演了重要角色［6］。泛素化过程是泛素对底物蛋白进行分类、筛选及处理的耗能过程，也是一种蛋白质翻译后的修饰(post-translational modification，PTM)的过程。泛素化系统主要包括泛素(ubiquitin)、泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme，E2)、泛素连接酶(ubiquitin protein ligase，E3)，泛素链延长因子(E4)［7］。泛素化修饰可作用于细胞中广泛的底物蛋白，故其可参与细胞凋亡、增殖、转录调节、DNA损伤修复及炎症免疫应答等细胞活动，它所扮演的角色也远比我们最初认为的要重要的多［8，9］。泛素化过程在心肌肥厚中的关键作用已经被证实，c-Jun、c-Fos以及P53等参与心肌肥厚的信号分子都可以被E3特异性的识别。此外，体内胰岛素水平、反转录病毒的出芽等过程的调控也被证实有泛素化过程的参与［10，11］。

1．泛素化过程的主要因子:泛素是由76个氨基酸组成的具有特殊稳定性的小分子热稳定蛋白，广泛存在于哺乳动物的细胞中。泛素化修饰是指底物蛋白在酶的催化作用下与一个或多个泛素分子连接在一起从而完成对底物蛋白的修饰。一般认为多泛素化修饰后的蛋白质更易被水解，研究也证实细胞内的底物蛋白以多泛素链的形式被标记后再由蛋白酶体进行识别降解。靶蛋白被泛素作标记的实质是靶蛋白质上的一个赖氨酸(Lys)与泛素末端甘氨酸(Gly)之间形成共价结合而发挥生物作用，在此过程中作为热稳定蛋白的泛素也能保持自己的结构与功能不发生变化。

E1是泛素与底物蛋白结合所需的第1个酶。E1的高效性使其在泛素浓度很低的情况下就能够激活泛素，即E1在耗能的条件下通过泛素C端甘氨酸残基与酶活性部分的半胱氨酸结合形成高能键，泛素被E1激活，产生了高能的E1-硫醇-酯-泛素媒介，随后被激活的泛素被转移到E2。随后E2在泛素化过程中发挥作用，其具体作用机制尚不清楚，需要进一步的研究。E2在结构上包含1个含有半胱氨酸位点的保守核心结构域与多个基因，在一定程度上参与了泛素化特异性与效率的调节。在蛋白底物多聚泛素化的过程中，E2在E1与E3之间往返运行，促使底物蛋白与泛素联结，也可与E3联合将泛素转移为高能E3-泛素媒介。此外，E2在DNA修饰、生长发育过程中也起到一定的作用。E3是泛素化途径中的第3个酶，也是研究最多的酶。根据E3包含的具有识别功能的结构域的不同可将其分为以下两个家族:①HECT家族，此家族包含了保守性的HECT结构域，该结构域可直接催化底物蛋白的泛素化过程，即通过与泛素的硫酯键连接形成作为过渡的ub-E3，随后将泛素转移到靶蛋白上;②RING-finger家族，包括了c-Cbt，APC和SCF等。RING结构域在泛素转运过程中不能像HECT结构域可以直接与ub形成过渡的复合物ub-E3，而是先与Ub-E2形成复合体，随后真接将Ub转移至靶蛋白上。E3决定了靶蛋白的特异识别性，这一点在泛素化途径中具起到了重要的作用［12］。E4是最近发现新的泛素结合途径成员，它是一种具有蛋白酶体靶向定位的、泛素结合底物的、具有泛素化作用等特点的结合因子。E4主要参与靶定带有融合N端的稳定泛素化位点的嵌合体模型底物的过程。E4可通过结合到这些结合物的泛素基序上(E1、E2、E3酶结合的位置上)，去促进多聚泛素链的装配。

2．泛素化过程与心肌肥厚的关系:泛素在E1的作用下活化，与E1以共价结合的方式连接，产生高能的E1-硫醇-酯-泛素链接，而后泛素被转移到E2。随后E2-泛素复合体被E3识别，能将已经被活化的泛素从E2高效的转移到靶蛋白。一旦上述过程发生紊乱，就可能导致蛋白酶体功能障碍，继而导致心肌细胞内不需要的蛋白水平不断升高，最终引起心肌细胞的功能障碍甚至凋亡，在一些重要的心血管系统疾病的发生、发展中起到了重要的作用。有证据表明在出现颈动脉斑块破裂的糖尿病患者中UPS起到了推波助澜的作用，这与UPS调节由氧化应激引起的炎症有关。

二、蛋白酶体

1．蛋白酶体组成与功能:蛋白酶体可分为20S蛋白酶体和26S蛋白酶体两种形式，细胞内最普遍存在的蛋白酶体是26S蛋白酶体，它是一种包含有1个20S核心颗粒和2个19S调节颗粒的桶状结构，也是一种依赖ATP的蛋白水解复合体［13］。20S核心颗粒是由4个七元环叠成的蛋白酶体的降解核心，其两侧外环由αl-7亚单位组成，主要对底物的识别起作用;两个内环由β1-7亚单位构成，主要对底物的降解起到催化的作用。最新的研究证明不同的β亚单位具有不同的蛋白酶活性，包括了胰蛋白酶样活性、糜蛋白酶样活性和半胱氨酸蛋白酶样活性，分别负责分解羧基酸碱性、疏水性或芳香性、酸性氨基酸残基，促使蛋白质降解，释放出短肽片段［14］。19S调节颗粒包含了由10个基底蛋白分子组成的碱性亚复合体和9个蛋白分子组成的亚复合体，它既可使底物蛋白去泛素化又可以识别多聚泛素化的底物。蛋白酶体可打断被标记的靶蛋白的肽键促使其降解，但泛素的结构与功能不会产生影响。临床上对蛋白酶体的关注程度正迅速增加，大量研究证明蛋白酶体的功能紊乱与亨廷顿舞蹈症、帕金森综合征、阿尔茨海默病等疾病密切相关［15］。此外，UPS功能紊乱对一些重要的心血管系统疾病如心肌病、心力衰竭、动脉粥样硬化等的发生和发展具有重要的病理生理学意义。

2．蛋白酶体与心肌肥厚:尽管蛋白酶体在心肌肥厚中的具体作用有待研究，但在一些心肌肥厚的模型中检测出了蛋白酶体亚单位蛋白质表达的增强，这是因为蛋白酶体促进了心肌肥厚的抑制因子的降解，如早期诱导环腺苷酸抑制因子(inducible cyclic AMP early repressor，ICER)。此外蛋白酶体还参与了蛋白质降解、修改延长因子的活动等机制。在压力负荷诱导的心肌肥厚的动物模型中也发现心肌细胞内蛋白酶体亚基蛋白的水平与心肌肥厚呈正相关。此外，在酵母载体实验表明，细胞压力负荷的增加促进了胞质的蛋白酶体易位到细胞核外围，并通过超表达H11激酶伴侣蛋白和热休克蛋白22来维持细胞的稳态。这个反应同时伴随着糜蛋白酶的活性与蛋白酶体蛋白表达上的增强，以及α7蛋白质的磷酸化作用的减弱［16］。

三、蛋白酶体抑制剂

1．蛋白酶体抑制剂作用机制:在心脏负荷增加的情况下，心脏蛋白酶体功能可发生紊乱，进而产生一系列的变化并进展为心肌肥厚。蛋白酶体抑制剂抑制心肌肥厚的发生、发展是多种因素共同决定的，其机制可归纳为以下几点:①抑制UPS的功能可以抑制UPS对G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinases2，GRK2)的降解［17］;②抑制 UPS 可以抑制UPS对有含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶富集功能域的凋亡抑制因子的降解;③抑制UPS的功能可抑制核因子κB(NF-κB)参与的炎症途径的激活［18］。在动物模型中也先发蛋白酶体抑制剂能够抑制蛋白酶体功能紊乱引起的生理性和病理性心肌肥厚。

2．肽硼酸酯类抑制剂:肽硼酸酯类抑制剂是一类活性较高的蛋白酶体抑制剂，其代表性药物硼替佐米是第1种上市的蛋白酶体抑制剂，它是一种具有较高可逆性和选择性的26S蛋白酶体抑制剂，结构上与PS-519不同但却有着相似的作用，可特异性的与蛋白酶体20S亚基的活性位点结合，从而起到抑制26S蛋白酶体活性的作用［19］。硼替佐米的不同计量对会对心脏造成不同的影响，较低剂量的硼替佐米可以阻止或阻断心肌肥厚的过程，但高剂量硼替佐米则会使心脏承受额外的压力，甚至恶化过渡到心力衰竭。同时也必须提及，硼替佐米对多种肿瘤细胞具有细胞毒性，可延迟肿瘤的生长，现已治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的常用药物。上文中提到的PS-519，也是一种作用于26S蛋白酶体的核心蛋白酶的蛋白酶体抑制剂，它可以永久抑制20S蛋白酶体的糜蛋白酶的活性并能阻断κB抑制蛋白(IκB)降解。这不仅可以阻止核移位也可以防止在心肌肥厚过程中起到重要作用的NF-κB信号通路被激活，在对抗心肌肥厚的发生发展过程有着显著的效果。

3．肽醛类抑制剂:肽醛类抑制剂是一种类蛋白酶体抑制剂，可以高效、特异性的抑制蛋白酶体的活性。其代表性的药物是MG132，即三肽基乙醛，它通过分子中的醛基与蛋白酶体活性中心苏氨酸上的羟基形成可逆性的半缩醛结构，从而起到抑制蛋白酶体水解活性、对抗心肌肥厚的作用［20］。最新的研究也证明MG132通过调控ERK1/2和 JNK1信号通路影响心肌肥厚的过程。尽管在一定的剂量范围内它呈现出浓度依赖性，超过此范围MG132则可能产生细胞毒性。MG132对血压几乎没有影响，因此它可以做心肌肥厚的药理抑制剂，而不必担心血压波动对实验结果的影响。

四、展 望

众所周知，心肌肥厚是一个代偿性的过程。心肌肥厚是心肌细胞内的蛋白质不断累积，即细胞内蛋白质的合成大于蛋白质的分解产生的结果。同时，作为蛋白质稳态的重要调控手段的UPS，可以通过调控不同的环节对心肌肥厚的过程进行干预，这使其可能成为心肌肥厚干预的新靶点。蛋白酶体抑制剂通可以过抑制蛋白质合成，抑制了长期内质网应激所造成的对心脏的不利影响并可以减少心肌细胞的凋亡，这为今后心肌肥厚的治疗提供了新的思路。展望未来，一些蛋白酶体抑制剂(如MG132)可以作为抗高血压药的组成部分，在维持患者血压的相对稳定的情况下，特异性地解决患者心肌肥厚和心脏收缩功能下降等问题，仍需要在进一步的动物实验和临床治疗中评价蛋白酶体抑制剂对心肌细胞作用的有效性、安全性和最佳剂量。

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