乳腺癌转移抑制因子(BRMS1)在人乳腺癌细胞系中的表达受体研究

张雨禄， 胡三元

(山东大学医学院 山东济南250012)

0 引言

近年来，随着肿瘤分子生物学研究的进展，肿瘤转移抑制基因逐渐被认识并且成为研究的热点．研究认为，肿瘤转移抑制基因在转移肿瘤中呈低表达，而在非转移肿瘤中呈高表达，因此认为其能参与肿瘤的转移途径而起到抑制肿瘤转移的作用．乳腺癌转移抑制因子(breast cancer metastasis inhibitory factor 1，BRMS1)是2000年新发现的定位于人11号染色体的肿瘤转移抑制基因，已被证明在不同类型的肿瘤中有表达，包括非小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌等，并且能通过抑制肿瘤的迁移、侵袭等抑制肿瘤的远处转移［1－2］．近年，亦有学者研究BRMS1在乳腺癌转移中的作用，但BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中的表达研究甚少．本文通过分子生物学方法研究BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中的表达，旨在发现BRMS1在人乳腺癌细胞系的受体基因序列，为研究者进一步研究BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中的生物学功能提供依据，为临床医师从基因学角度对人乳腺癌进行治疗及预防其远处转移提供参考．

1 材料和方法

1．1 材料

细胞系:人乳腺癌细胞系:MDA MB-231和MCF-7从欧洲动物细胞培养机构购买(ECACC，英国)，在37℃潮湿的5%CO2培养箱中培养．野生型(MDA231WT，MCF-7WT)细胞在普通培养液中培养:10%胎牛血清(FCS)+ABS(氨苄青霉素，两性霉素B，链霉素)．配比方法:用50 mL的胎牛血清，3．3 g氨苄青霉素，12．5 ng两性霉素B和5 g链霉素，配置在500 mL 0．4%酚红溶液中．质粒(MDA231PEF，MCF-7PEF)在维持培养液中培养(在普通培养液中加入27．5 μL Blasticidin)．

材料:进行PCR所用引物及核酶都是从Sigma-Aldrech公司(英国)购买(引物序列见表1)．PCR混合物从Sigma-Aldrich公司(英国)购买．反转录试剂盒是由美国应用生物系统公司提供．除非另有说明，所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich公司．

1．2 方法

1．2．1 转化

质粒(MDA231PEF，MCF-7PEF)被克隆到大肠杆菌中并进行重构，通过PCR实验选择正确的质粒结构并进行扩增．用基因质粒提取试剂盒(Sigma-Aldrich，美国)进行纯化．

1．2．2 RNA 提取、反转录

在RNA提取实验中，用TRI反应物(T9424-200 ML，Sigma-Aldrich，美国)，按照说明书的参考步骤，对MDA MB-231和MCF-7细胞系进行RNA提取，然后用分光光度计(WPA紫外分光光度计，英国)对RNA进行定量．使用iScript cDNA分析仪(AB Applied Biosystems，Thermal Cycler，新加坡)进行反转录实验，将RNA反转录成cDNA．

1．2．3 BRMS1 部分基因敲除实验

为达到BRMS1的核酶转基因目的，使用核酶及相应PCR引物，通过PCR实验将BRMS1部分基因敲除，所用引物组为BRMS1rib1F/R．PCR反应条件如下:72℃ 10个循环，68℃ 10个循环，64℃ 10个循环，60℃10个循环，55℃ 20个循环，将PCR产物在大肠杆菌中进行克隆与增殖．为了验证正确序列的核酶转基因产物，进行了PCR验证实验，引物组T7F+RBBMR作为阴性对照组，引物T7F+RBTPF为阳性对照组(所用引物序列见表1)，通过PCR测序及克隆分析，对正确的转基因序列克隆组进行扩增、纯化及提取．将基因部分敲除的BRMS1重命名为MDA231BRMS1rib1和MCF7BRMS1rib1．

1．2．4 聚合酶链反应(PCR)

将MDA MB-231和MCF-7细胞系的cDNA作为模板进行PCR实验，所用PCR仪器为T-Cy Thermocycler(AB Applied Biosystems，Thermal Cycler，新加坡)，所用PCR反应混合物为Taq Green，2×反应混合物．PCR条件如下:94℃、30 s变性过程，55℃、40 s退火过程和72℃、1 min扩增过程，分别设置25、30和35个循环．把PCR产物在1% 琼脂糖凝胶、100 V电压下进行电泳30 min．用Sybr Safe DNA胶染色剂(Invitrogen，Molecular Probes，美国)染色40 min，最后在一个超亮LED蓝色显影仪(Syngene，U:Genius 3)显示下采集图片．

表1 实验中所用引物Tab．1 Primers in assays

2 结果

2．1 BRMS1及其受体在乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中均有表达

为研究BRMS1及其受体在乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中的表达，进行了PCR实验．实验设3－磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)F8/R8对照组及引物R8/F8和R9/F9组．结果显示，BRMS1及其受体在乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中均有表达，但BRMS1及其受体在引物F9/R9组中的表达比引物F8/R8组中表达更强，如图1所示(PCR实验重复3次)．

图1 BRMS1及其受体在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7的表达Fig．1 Expression of BRMS1 in human breast cancer cell lines of MDA MB-231 and MCF-7

2．2 部分基因敲除的BRMS1(MDA231BRMS1rib1，MCF7BRMS1rib1)及其受体在乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中的表达减弱

用PCR实验研究BRMS1部分基因敲除后(MDA231BRMS1rib1，MCF7BRMS1rib1)在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中的表达．结果显示，BRMS1部分基因敲除后(MDA231BRMS1rib1，MCF7BRMS1rib1)在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中表达减弱，见图2(PCR实验重复3次)．

图2 BRMS1部分基因敲除后在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中表达减弱Fig．2 Expression of BRMS1 with part genes knocked down was weakened in the human breast cancer cell lines of MDA MB-231 and MCF-7

3 讨论

最近的许多研究都集中在恶性肿瘤转移的分子机制上，如对肿瘤转移抑制基因的研究，近几年报道，转移抑制基因主要影响肿瘤转移的过程，而不是影响癌细胞的增殖［2－3］．乳腺癌转移抑制因子1(BRMS1)就是一个具有转移抑制活性的因子，BRMS1是转移抑制基因家族中的一个重要的家庭成员，它能抑制肿瘤的转移但不阻断肿瘤的生长［4－5］．研究报道，BRMS1能明显降低无胸腺小鼠来自于卵巢癌、黑色素瘤及乳腺癌的肿瘤细胞的肺转移［1，6］，证实了BRMS1存在于卵巢癌、黑色素瘤及乳腺癌的组织中，并且抑制肿瘤细胞的远处转移．研究发现，在乳腺癌脑转移中，BRMS1的mRNA表达水平低于原发肿瘤，并且与相匹配的正常乳腺组织相比，BRMS1在乳腺肿瘤中含量降低［7－10］．尽管BRMS1已被证实在抑制乳腺癌的远处转移中起到一定的作用，但其作用机制及参与途径仍不是很明确，BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231及MCF-7中的表达及其受体仍不是很清楚．因此，发现BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中的受体基因序列，对于进一步研究BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中的生物学功能，以及从基因学角度对人乳腺癌进行治疗及预防其远处转移具有重要意义．

本研究通过PCR实验方法，从分子生物学水平上证实了BRMS1及其受体在人乳腺癌细胞系MDA MB-231及MCF-7中均有明显的表达，从而发现BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231及MCF-7中的受体基因序列．从图1中可以看出，在引物组F8/R8及F9/R9的PCR反应中，BRMS1在MDA MB-231及MCF-7细胞系中均有表达，但在引物F9/R9的反应中表达增强，提示引物F9/R9所对应的基因序列与BRMS1在MDA MB-231及MCF-7细胞系中的受体序列吻合度较高．通过酶切反应将BRMS1部分基因敲除后，BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中的表达也有相应的减弱，如图2所示，提示核酶BRMS1rib1F/R的基因序列能成功地将BRMS1的部分基因敲除，从而为进一步研究BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7的功能试验提供正确的基因序列．

在今后的研究工作中，在发现BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7中的表达及其受体的基础上，进一步进行生物功能试验，研究BRMS1在人乳腺癌细胞系MDA MB-231和MCF-7的生长、迁移、侵袭等方面的作用，为乳腺癌的临床治疗提供分子生物学技术．通过增强BRMS1在人乳腺癌中的含量及作用，达到抑制乳腺癌细胞远处转移的目的，从而减少乳腺癌的转移率，提高患者的长期生存率．

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