应用于湿热灭菌的生物指示剂现状与分析

肖 璜，马仕洪，崔 强，胡昌勤*

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050;2.华瑞制药有限公司，江苏 无锡 214092)

世界各地每年都有因灭菌不彻底造成的感染事件的报道。因此，国内外对于灭菌监测都给予了高度重视并制定相应的法规进行支持保障［1］。灭菌监测主要有3种形式:物理监测、化学监测和生物监测。物理监测通过对时间、温度、压力等物理参数进行测量，能够确认灭菌工艺运行状态是否符合设定要求，可估测灭菌工艺对微生物的致死性［2］。化学监测是使用某些热敏化学物质配成印墨后印制成指示剂，通过其颜色改变反映所经历的温湿度及压力变化［3］，从而反映被灭菌器物是否经历设定的灭菌过程。生物监测是通过标准化的菌株和合乎要求的抗性来考察微生物的杀灭情况，直接体现了整个灭菌过程是否达到需求，被认为是灭菌效果成功与否的最终判定［4］。本文对生物监测所使用的生物指示剂进行分析综述。

1 生物指示剂的研究历史

19世纪末，一名英国医生报告了使用鸡蛋作为生物指示剂进行灭菌效果判定的案例，主要是通过鸡蛋的凝固来判定灭菌效果，虽然这种方法较为粗糙且可靠性存在问题，但首次从概念上引入了生物指示剂，使人们开始意识到需要开展灭菌监测活动。因为嗜热脂肪芽胞杆菌所产芽胞无致病性、无热原、无毒，且对压力蒸汽的抗性强于大多数微生物［5］，美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)于1955年开始使用它来制备生物指示剂。生物指示剂的商品化则是从1957年一家美国公司在芝加哥的全美医院协会上推荐使用开始。

2 生物指示剂的应用现状

卫生医疗领域对染菌物品采用过度杀灭的灭菌方法，而某些热稳定性较低产品则需按产品特性经过完备的灭菌工艺开发和确认环节后才能确定其灭菌工艺。由于能够直观反应微生物在经历灭菌过程后的存活程度，生物指示剂的应用并不局限于灭菌监测，还能够应用在程序开发中的关键参数设定、系统适应性实验、变更控制等环节［6-7］。目前国内已经开始探索应用生物指示剂验证灭菌工艺。

3 生物指示剂的类型划分

美国药典(The United States Pharmacopeia，USP)将生物指示剂分为3类:①由微生物孢子和载体(可能是碟状或条状的滤纸、玻璃、塑料以及其他材料的)包装而成的第一类生物指示剂;②由可接种在产品表面或内部的孢子悬液构成的第二类生物指示剂;③将微生物恢复的生长培养基包含其中的第三类生物指示剂，也称为自含式生物指示剂［8］。

市场上有标准推荐的相关菌株销售，开展工作时基于经济因素考虑，有部分用户自行制备第一类或第二类生物指示剂，但操作的不便利性(需要无菌以及转种等技术)使得更多的用户选择使用第三类生物指示剂。相比于前2种指示剂，第三类生物指示剂具有不需自配培养液、取材简单不易造成二次污染、培养结果明显、生物检测合格率高的优点［9］，但需要观测24～48 h才能得到最终结果。为了提高使用快捷性，市场上出现了快速生物指示剂。基于芽胞生长初始阶段某类酶的激活可促使非荧光基质转化为荧光物质的原理［10］，快速生物指示剂能够将检测时长缩短至几个小时，也有人将其作为第四类生物指示剂。

4 菌株使用

目前，嗜热脂肪芽胞杆菌被各国药典作为热力灭菌生物指示剂的标准菌株收录且被大规模商品化使用。其他耐热芽胞菌，如生孢梭菌等也被报道用于湿热灭菌工艺的验证［6］。芽胞形成阶段所产生的名为吡啶二羧酸的特殊物质与DNA以及细胞内的酶形成复合物，使得处于恶劣环境的芽胞休眠存活［11］。因此，推荐菌株多采用芽胞类细菌。近年出现了其他暴露条件(VHP)下非芽胞类细菌抗性更高的相关报道［12］，但在湿热灭菌条件下，芽胞类细菌作为生物指示剂仍是标准化的选择。

5 考察因素

生物指示剂有2项主要性能:孢子数量和以D值表征的对灭菌工艺的抗性。

5.1 孢子数量

灭菌是指杀灭微生物的过程。微生物存活概率(也称无菌保证水平，Sterility Assurance Level，SAL)常常被用来评价医疗产品的灭菌程度。各国药典均对灭菌制剂进行了量化描述:SAL≤10－6，即经灭菌后产品中污染微生物存活概率不大于百万分之一。目前商品化湿热灭菌用生物指示剂的孢子数量基本控制在106的数量级。2010年版中国药典中规定“对灭菌手段耐受性差的产品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生产工艺中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌种和孢子数量”。由于孢子数量是衡量灭菌工艺生物杀灭力的重要参数，故需事先确定其适用性，方可应用于产品灭菌工艺的开发和验证。

孢子数量同时是基于商品化产品稳定性考察所需要严格控制的内容，USP要求生物指示剂生产厂家应能提供效期内的微生物总数数值;生物指示剂使用者在应用前能够对每使用单位的平均菌落数进行测定［8］。然而国内市场上某些商品化产品在效期内的微生物总数不能达到其标称。

5.2 D 值

5.2.1 D值的影响因素 D值是生物指示剂需要考察的关键因素。D值定义为在规定的暴露条件下，灭活90%的试验菌所需的时间或辐射剂量［13］，它是微生物对于暴露损伤抵抗力强弱最直接的表征。D值的影响因素较多，在制备形成阶段，各种营养成分往往对微生物自身的D值产生影响［14-15］;在应用过程中，生物指示剂 D值受到外部因素影响，例如第一类生物指示剂中菌片的外包装材料［16］、第二类生物指示剂中孢子悬液所加入的各种介质［17］和第三类生物指示剂整体包装材质。

5.2.2 D值的测定 D值的测定可采用2种方法，一是直接计数法，二是部分阴性法［13］。前者需使用不同的暴露时间下存活芽胞数的对数值做回归方程;后者需统计不同暴露时间的存活或死亡样本数，选择不同统计公式计算。无论采用哪种方法，都需要进行平行样本的测定。但传统的灭菌器由于腔体内存在冷点和升降温过程每个循环不同，样本的平行性难以保证。因此，D值测定需使用专门的仪器——抗力仪或油浴装置［18］。不同于普通的灭菌器，抗力仪是被设计用于建立精确的、可复现的灭菌环境的测试设备。由于其对于准确测量、精确控制及快速变化速率的要求，已经接近商用过程控制和校准仪器准确度的极限［19］。目前，国内已能够自主研发和生产应用于湿热灭菌的抗力仪。

USP要求生物指示剂生产厂家应能提供包括D值、D值测定方法等相关信息;生物指示剂使用者在应用前能够对生物指示剂D值进行评估［8］。然而，国内生产厂家所提供的D值仅为使用菌株的参考D值而非测量值，而使用方也往往不能对D值进行评估。出现了使用中基于化学监测发现灭菌程序异常而生物监测并未发现问题的相关报道［20］，从侧面佐证了目前某些商品化生物指示剂产品的质量存在着问题。

6 结 语

目前，在生物指示剂制备、销售、使用整体环节中，针对产品评估尤其是D值的测定与评估存在技术领域上的空白，可以由第三方提供相关服务进行弥补，最终衔接完善整体环节。同时，应加大对生物指示剂的探索和开发力度，实现生物指示剂在灭菌工艺验证的整体流程中应用。

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