EMMPRIN糖基化突变质粒的构建及功能检测

赵超悦，宋润敏，秦 晖，王 娜，杨 柳，李 江

（1.吉林大学口腔医院口腔修复科，吉林 长春 130021；2.东北师范大学生命科学学院膜通道实验室，吉林 长春 130024）

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）又称CD147，其高表达在肿瘤中较为常见。近几年来EMMPRIN是肿瘤领域中的研究热点。EMMPRIN在多种正常上皮细胞表达，但其表达水平较低；而在肿瘤细胞中表达水平较高，例如在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌和结肠癌等多种恶性肿瘤细胞中均高表达［1－4］。EMMPRIN表达水平与肿瘤进展关系密切，其高表达能够反应出肿瘤的恶性进展和高死亡率，并能预测其不良预后。EMMPRIN作为膜蛋白是基质金属蛋白酶（MMP）的重要诱导因子，通过调节MMP水平促进肿瘤细胞的迁移。然而，EMMPRIN与肿瘤细胞的增殖关系尚不清楚，EMMPRIN是否影响肿瘤细胞的增殖／凋亡信号需要深入研究。EMMPRIN作为一种在机体中广泛存在的跨膜糖蛋白，其生物学功能的发挥很大程度依赖于与蛋白质相连接的糖链，不同的糖基化形式赋予其不同的生物学功能，尤其表现在肿瘤侵袭及转移过程中［5］。研究［6］发现：肿瘤细胞表面糖基化异常与肿瘤细胞的侵袭和转移有密切关系，这些变化包括糖链结构在表达水平上的差异以及特殊糖链结构的出现。但尚无针对EMMRPIN糖基化位点突变的相关报道，本研究主要针对EMMPRIN预测的3个糖基化位点构建单点突变质粒，研究其糖基化位点突变后对EMMPRIN蛋白稳定性和功能方面的影响。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株、主要试剂和仪器 EMMPRIN／GFP质粒由华盛顿大学Dr.Pushparsky设计［7］并惠赠；大肠杆菌DH5α和人胚胎肾脏细胞HEK293T由东北师范大学遗传所提供；细胞培养所用试剂购自美国Gibco公司；限制性内切酶BamHⅠ、ExTag DNA聚合酶、DNA Marker DL 2000为日本TaKaRa公司产品；蛋白相对分子质量标准品及质粒提取试剂盒购自美国Pronega公司；EMMPRIN多抗体购自SanTa CRUZ Biotechnology公司，产品货号为SC－13976。Bioer TC－96／T／H（a）基因扩增仪购自杭州博日科技有限公司，LX－100手掌型离心机购自江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司，XW－80A旋涡混合器购自上海精科实业有限公司，JY 200C电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司，电子天平购自梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司，CO2培养箱购自德国Heraeus公司。

1.2 引物设计 采用Megaprimer PCR技术，根据EMMPRIN／GFP序列和突变位点自行设计3组6条引物，EMMPRIN序列中第44、152和186位设计的引物序列分别为第44位：上游引物5′－TCCTTGCAGGACAGCGCCACAGAG－3′，下游引物5′－GCTGTCCTGCAAGGAGCAGGTGAG－3′；第152位：上游引物5′－CTCATGCAGGGCTCCGAGAGCAGG－3′，下游引物5′－GGAGCCCTGCATGAGGGCCTTGTC－3′；第186位：上游引物5′－CGGTGCCAGGGCACCAGCTCCAAG－3′，下游引物5′－GGTGCCCTGGCACCGGTACTGGCC－3′，其中下划线为引入突变氨基酸的密码子。PCR反应：采用50μL体系，10×PCR反应缓冲液5μL，上下游引物（10μmol·L－1）各1μL，dNTP（2.5mmol·L－1）4μL，模板（0.5mg·L－1）2μL，ddH2O 36μL，最后加Ex Tag DNA聚合酶（2.5U·μL－1）1μL。PCR扩增条件：95℃预变性1min；95℃变性40s，60℃退火1min，68℃延伸10min；72℃延伸、补全10min；循环数：12个。DpnⅠ消化：DpnⅠ消化PCR产物，酶切体系DpnⅠ（10U·μL－1）1μL，10×DpnⅠ反应缓冲液5μL，PCR产物44μL，37℃保温1h。转化大肠杆菌DH5α感受态，取5μL DpnⅠ消化PCR产物，加入大肠杆菌DH5α感受态，轻轻混合，冰浴30min，42℃热休克90s，再冰浴2min，最后全部涂布于氨苄青霉素抗性LB平板（氨苄青霉素浓度为1000mg·L－1），37℃温箱过夜培养。

1.3 提取质粒、酶切鉴定及测序 挑取单菌落，碱法提取质粒，用BamHⅠ行酶切鉴定，10μL酶切体系：BamHⅠ1μL，10×反应缓冲液1μL，待鉴定质粒5μL，ddH2O 3μL，37℃保温2h，选择酶切鉴定确认诱变成功的质粒送上海生工生物技术服务有限公司测序。

1.4 细胞培养 HEK293T细胞可传代培养，完全培养液为DMEM＋10%（体积比）新生牛血清＋青霉素，每3d换液1次，5～6d传代1次。

1.5 Western blotting法检测EMMPRIN蛋白表达 细胞裂解后经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶电泳结束后，聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）在100%甲醇中浸泡30s以上、重蒸馏水浸泡1min，取出后放入电转缓冲液中。凝胶与PVDF膜一起按照电转仪装置说明书要求安装，形成“三明治”结构，放入电泳槽中，加电转液，在100V电压下转膜。转膜结束后，用TBST配制的5%（W／V）的脱脂奶粉室温封闭PVDF膜1h。然后加入用脱脂奶粉稀释的一抗，4℃下孵育过夜。用TBST缓冲液洗膜3次，每次5min。以HRP标记二抗室温下孵育，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min。在暗室中曝光，显影，定影。

1.6 细胞免疫荧光实验 取对数生长期的细胞以20%～30%的密度铺到12孔板中，将其培养于37℃、95%湿度和5%CO2孵箱中，将提取的纯度较高的质粒用OPTI－MEM转染到细胞中。48h后荧光显微镜下观察细胞形态学变化。

1.7 MTT法检测细胞增殖 HEK293T细胞以4×10－3／孔的密度接种到96孔板（每孔100μL培养基），设对照组和实验组，37℃、5%CO2温箱内常规培养24h后应用Lipofectamine 2000转染，每种转染设6个平行孔。37℃、5%CO2温箱内常规培养。24、48、72和96h后分别加入MTT溶液（5g·L－1）10μL，37℃、5%CO2温箱内继续培养，4h后每孔再加150μL DMSO，在酶标仪上490nm波长处测定其吸光度（A）值。A值可间接反应细胞数量，用以检测细胞活性。对照组细胞生存率为100%，其余各组细胞生存率＝（各实验组A值／对照组A值）×100%，相同实验重复3次。

1.8 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析。细胞存活率以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 酶切鉴定 构建3个糖基化单点突变质粒EMMPRIN／GFP（N44Q）、EMMPRIN／GFP（N152Q）和EMMPRIN／GFP（N186Q）后，酶切鉴定其是否突变成功，结果显示：BamHⅠ单酶切后，糖基化单点突变质粒不破坏酶切位点，野生型与突变型均得到7500和800bp的片段。酶切结果见图1。

图1 EMMPRIN突变型BamHⅠ酶切鉴定电泳图Fig.1 Electrophoretogram of identification of mutant－type EMMPRIN digested by BamHⅠ

2.2 测序鉴定 测序结果显示：第44位天冬酰胺（AAT）突变成谷氨酰胺（CAG），第152位天冬酰胺（AAC）突变成谷氨酰胺（CAG），第186位天冬酰胺（AAC）突变成谷氨酰胺（CAG），成功构建EMMPRIN／GFP（N44Q）、EMMPRIN／GFP（N152Q）和EMMPRIN／GFP（N186Q）糖基化位点突变质粒，证实突变成功。测序结果见图2（插页四）。

2.3 Western blotting法检测蛋白表达 将EMMPRIN以及其3个糖基化位点突变质粒分别转入HEK293T细胞中，检测EMMPRIN蛋白表达，结果显示：EMMPRIN糖基化位点突变后，EMMPRIN蛋白的对应位置不能糖基化，只表现为非糖基化形式。见图3。

图3 EMMPRIN野生型与突变型蛋白的表达Fig.3 Expressions of wild－type and mutant－type EMMPRIN proteins

2.4 免疫荧光检测细胞形态学变化 将EMMPRIN及其糖基化突变的重组质粒转染进入HEK293T细胞中，发现突变后的重组质粒均可在细胞中表达，EMMPRIN／GFP（N44Q）、EMMPRIN／GFP（N152Q）和EMMPRIN／GFP（N186Q）细胞形态发生变化，细胞核分裂相显著减少，伪足数目减少，胞浆外有一些颗粒滞留。见图4（插页五）。

2.5 MTT法检测细胞增殖 野生型细胞存活率显著高于对照组（P＜0.05）；而EMMPRIN糖基化位点突变后，EMMPRIN（N44Q）、EMMPRIN（N152Q）和EMMPRIN（N186Q）细胞存活率均显著低于野生型（P＜0.05）。见表1。

表1 EMMPRIN野生型与突变型不同时间点的细胞存活率Tab.1 Survival rates of wild－type and mutant－type EMMPRIN at different time points（，η／%）

表1 EMMPRIN野生型与突变型不同时间点的细胞存活率Tab.1 Survival rates of wild－type and mutant－type EMMPRIN at different time points（，η／%）

＊P＜0.05compared with vector；△P＜0.05compared with wild－type EMMPRIN.

Plasmid±4.515297.017±11.258 Wild type EMMPRIN 112.664±7.364＊132.709±7.385＊204.684±5.100＊339.433±12.229＊EMMPRIN（N44Q）89.465±0.263△101.116±2.668△160.879±1.283△288.349±14.131△EMMPRIN（N152Q）75.112±3.372△84.364±2.319△129.655±0.597△251.268±1.992△EMMPRIN（N186Q）65.399±3.127△68.047±1.272△102.075±0.623△195.535±2.87724487296 Vector 100.000±0.586114.223±1.857173.729 Survival rate（t／h）△

3 讨 论

EMMPRIN是一种跨膜糖蛋白，并具有酪氨酸蛋白激酶活性，属于免疫球蛋白超家族，参与细胞间的识别。EMMPRIN在体内分布非常广泛，Chen等［8］观察高钙培养和EMMPRIN抗体对正常人角质形成细胞和皮肤鳞状细胞癌细胞分化相关形态学，认为EMMPRIN是一种新的低分化角质形成细胞标志蛋白，并可抑制角质形成细胞的分化。EMMPRIN在多种正常上皮细胞表达，但表达水平较低［9］。EMMPRIN的表达水平与肿瘤进展关系密切，其高表达代表肿瘤的恶性进展和高死亡率，并预测不良预后［10－11］。EMMPRIN的超表达还与肿瘤耐药性和肿瘤根治术后的复发密切相关［12］；所以EMMPRIN是诊断肿瘤和预后检测的标志物。EMMPRIN有3个预测的糖基化位点，分别是44、152和186位的天冬酰胺。本研究通过定点突变技术将3个天冬酰胺分别突变成谷氨酰胺，构建N44Q、N152Q和N186Q单点突变EMMPRIN质粒，研究EMMPRIN的糖基化位点与肿瘤信号转导的相关性。

EMMPRIN是一种高度糖基化的糖蛋白，其糖基化程度对蛋白稳定性和功能方面具有重要的影响。EMMPRIN糖基化与其生物学功能的发挥密切相关，在不同转移潜能的肿瘤细胞中EMMPRIN的糖基化形式及糖链结构不尽相同，肿瘤细胞表面糖基化异常与肿瘤的侵袭和转移能力有密切关系。将突变质粒分别转入HEK293T细胞中使其表达蛋白，本研究发现：3个糖基化位点单点突变后，EMMPRIN蛋白不能糖基化，只表现为非糖基化形式，说明突变后的EMMPRIN蛋白失去了糖基化的修饰作用；同时，免疫荧光实验结果显示：糖基化位点突变后，其细胞形态发生显著变化，细胞核分裂相减少，伪足生成数减少，胞浆外颗粒滞留，可能是糖基化位点突变后，导致细胞外基质无法上膜，不能参与信号转导过程。本研究揭示EMMPRIN的去糖基化可能调控肿瘤细胞信号转导的开关，但信号转导如何被开启，尚需要深入研究。

蛋白质糖基化的分子机制对于癌症等重大疾病的研究具有相当重要的指导意义，已成为生物学研究领域中的热点。EMMRPIN表达水平与肿瘤进展密切相关，MTT结果进一步证实：野生型细胞存活率显著高于对照组；而EMMPRIN糖基化位点突变后，EMMPRIN（N44Q）、EMMPRIN（N152Q）和EMMPRIN（N186Q）细胞存活率均显著低于野生型。EMMPRIN突变型可抑制肿瘤细胞的增殖，且随作用时间增加，其抑制作用减弱，EMMPRIN糖基化修饰与肿瘤细胞的增殖有关联。本研究结果为深入研究EMMPRIN在肿瘤细胞中如何发挥作用及其糖基化与肿瘤的何种信号通路相关提供了线索和依据。

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