生姜对小柴胡汤中柴胡皂苷a和黄芩苷肠道吸收的影响

蒋苏贞， 黄小兵， 吴海秀， 陈春丽， 向云亚， 邱锦涛， 丘志坚

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

生姜为姜科姜属植物姜ZingiberofficinaleRosc.的鲜根茎，是一种广泛应用的药食两用植物，生姜在仲景组方中占重要位置和比例[1]，而生姜对中药复方配伍究竟有何影响作用，尤其从药物与药物相互作用、相互转化或分解代谢，药物在肠道吸收等角度来阐述，作者尚未见相关文献报道。小肠是大多数口服药物主要的吸收部位, 预测药物小肠吸收的方法主要有离体法和在体法。在体法中大鼠单向肠灌流法 (SPIP)因不损伤研究部位的循环系统和生理环境从而能够较好地模拟人体的体内环境，且结果与人体试验结果相关性良好[2-3]，目前在国内外得到了广泛的应用。因此本课题采用大鼠在体单向肠灌流模型，以小柴胡汤中君药和臣药主要成分柴胡皂苷a和黄芩苷为指标，探讨配伍生姜对小柴胡汤水煎液中两种成分在肠道吸收的差异，从药物“配伍-吸收”角度阐述生姜对中药复方配伍的影响作用及其机理，为临床合理用姜提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 SummitP680型高效液相色谱仪(美国DIONEX 公司)；Chromeleon色谱工作站(美国DIONEX公司)；UVD170U紫外检测器；T6型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)； CU600型电热恒温水箱(上海一恒科学仪器有限公司)；蠕动泵(天津协达)；EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 药品及试剂 柴胡、黄芩、党参、清半夏、大枣、生姜、甘草均购自采芝林药业，经广州中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定为正品；柴胡皂苷a、黄芩苷(批号MUST-10090202，MUST-11052402)购自中国食品药品检定研究院；磷酸，乙醚，正丁醇为分析纯；甲醇，乙腈为色谱纯。

1.3 实验动物 SPF级大鼠，雌雄各半，体质量(210±20)g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证：SCXKC(粤)2008-0020。

1.4 溶液配制

1.4.1 Krebs-Ringer(K-R)液的配制 NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、CaCl20.37 g、葡萄糖1.4 g，加蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，即得。

1.4.2 小柴胡汤制备 含姜小柴胡汤：取柴胡32 g，黄芩12 g，清半夏12 g，党参12 g，生姜12 g，甘草10 g，大枣10 g，以水煎煮3次，第1次加水1 000 mL煎煮1 h,第2、3次各加800 mL水，各煎煮45 min，合并煎液，滤过，浓缩成200 mL。不含姜小柴胡汤制备：小柴胡汤药材中去除生姜，其它操作均同含姜小柴胡汤。

1.4.3 肠灌流液的配制 每100 g体质量大鼠取小柴胡汤5 mL，用K-R 液定容至50 mL，作为肠灌流液。 空白肠灌流液制备：取K-R液适量，按“大鼠在体单向肠灌流”方法灌流，收集流出液，即得。

2 方法与结果

2.1 大鼠在体单向肠灌流实验[4]

2.1.1 手术方法 实验前将大鼠禁食12 h(自由饮水), 腹腔注射20%乌拉坦。麻醉后, 将大鼠固定于恒温手术台上，沿腹中线切开长约3～4 cm的开口,选取约为10 cm回肠, 于切口的上下端插管，结扎固定, 将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿,用37 ℃的生理盐水冲洗肠段内容物至净。换用预热至37 ℃的台氏液以1 mL/min体积流量灌流10 min，平衡管路及肠段后换上预热至37 ℃的灌流液以0.2 mL/min体积流量灌流，30 min后，进液口处用已知质量的装有灌流液的小瓶以同样流速灌流，出液口处用另一已知质量的小瓶收集流出液,每隔25 min迅速更换一次灌流液小瓶和收集液小瓶，放冷至室温后，称量供试液小瓶和收集液小瓶的质量。分别取出0.5 mL后再分别称量供试液小瓶和收集液小瓶的质量。实验持续105 min后, 剪下灌流的肠段，测量肠段长度与直径。

2.1.2 数据分析[5]实验中小肠不仅吸收药物也吸收和分泌水分, 导致供试液体积变化, 故不能用直接测定药物浓度的方法计算药物的吸收。本实验采用重量法对灌流液的流入和流出的体积进行校正,消除其体积变化的影响，按下列方程式计算药物吸收速率常数 (Ka)和表观吸收系数(Papp):

Qin和Qout分别为肠道进出口灌流液的体积(mL，假设进出口灌流液的质量浓度均为1.0 mg/mL)；L和r分别为被灌流肠段的长度(cm)和横截面半径(cm)；Q为灌流体积流量(约0.2 mL/min)，V为灌流肠段的体积(cm3)。

2.2 灌流液中柴胡皂苷a、黄芩苷的测定

2.2.1 色谱条件 DiamonsilC18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；柴胡皂苷a流动相为乙腈-水，梯度洗脱，0～5 min为30∶70，5～25 min为40∶60，25～30 min为30∶70，体积流量1.0 mL/min，进样体积20 μL，检测波长210 nm。黄芩苷流动相为甲醇-水-磷酸(55∶45∶0.2),体积流量1.0 mL/min，进样体积10 μL, 检测波长280 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷a对照品2.03 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。精密称取黄芩苷对照品2.40 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 柴胡皂苷a的制备[6]：取各时间段收集的肠灌流液各4 mL，加入水饱和正丁醇，萃取3次，每次2 mL，合并正丁醇液浓缩至干，溶于1.5 mL水中，用乙醚萃取3次，每次1.5 mL,弃去乙醚层，加入水饱和正丁醇，萃取3次，每次1.5 mL,合并正丁醇液浓缩至干，残渣用适量甲醇溶解并定容至1 mL，即得。黄芩苷的制备[7]：取各时间段收集的肠灌流液各30 μL，精密加入甲醇3 mL，11 000 r/min离心10 min，取上清液，即得。

2.2.4 专属性试验 分别取柴胡皂苷a和黄芩苷对照品溶液、供试品及空白肠灌流液依法测定；结果显示，柴胡皂苷a和黄芩苷的保留时间分别为16.5 min 和8.2 min，两者峰形均良好，无杂质峰干扰，色谱图分别见图1、图2。

图1 肠灌流液中柴胡皂苷a对照品(A)、供试品(B)和空白肠灌流液(C)的HPLC图

图2 肠灌流液中黄芩苷对照品(A)、供试品 (B)和空白肠灌流液(C)的HPLC图

2.2.5 线性关系考察 取柴胡皂苷a对照品溶液适量，挥去甲醇，加入空白肠灌流液4 mL，配制成0.76、2.28、3.81、7.61、10.15、15.23 μg/mL的系列标准液，按柴胡皂苷a供试品制备方法进行制备，各质量浓度进样20 μL，以质量浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得柴胡皂苷a的标准曲线方程：Y=0.110X-0.056 (r=0.999 5)，表明柴胡皂苷a在0.76～15.23 μg/mL线性关系良好。

取黄芩苷对照品适量，挥去甲醇，加入空白肠灌流液3 mL，配制成1.0、2.0、4.0、8.0、10.0和12.0 μg/mL的系列标准液, 按黄芩苷供试品制备方法进行制备，各质量浓度进样10 μL，以质量浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得黄芩苷的标准曲线方程：Y=0.448X-0.302(r=0.999 4)，表明黄芩苷在1.0～12.0 μg/mL线性关系良好。

2.2.6 方法回收率试验 分别取5份柴胡皂苷a对照品溶液各0.1 mL，挥去甲醇，分别溶于4 mL大鼠空白肠灌流液，按柴胡皂苷a供试品制备方法进行制备，测定,计算柴胡皂苷a的回收率；测得柴胡皂苷a的回收率97.56%，RSD为2.54%；

分别取5份黄芩苷对照品溶液各50 μL，挥去甲醇，按黄芩苷供试品制备方法进行制备，测定,计算黄芩苷的回收率。测得黄芩苷的回收率为100.10%，RSD为2.21%。

2.2.7 精密度试验 分别取柴胡皂苷a对照品和黄芩苷对照品，连续进样5次,每次10 μL, 计算得仪器精密度；测得柴胡皂苷a的RSD为2.93%，黄芩苷的RSD值为1.54%；表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验 分别取同一份大鼠肠灌流液各4 mL和30 μL，按供试品制备方法分别制得柴胡皂苷a和黄芩苷供试品溶液各5份，进样测定，结果表明，柴胡皂苷a的RSD为1.44%；黄芩苷的RSD为1.13%，表明本方法重复性良好。

2.3 药物稳定性的考察 柴胡皂苷a在K-R液中2 h内稳定性较好，在含姜组与无姜组中所得药物浓度为原始药物浓度的(97.88±3.59)%和(98.15±4.54)% (n=3)，而黄芩苷降解残存率为(96.60±1.99)%和(95.51±1.63)% (n=3)，说明样品在K-R液中基本稳定。

在空白肠液中，2 h后含姜组与无姜组中柴胡皂苷a浓度为原始药物浓度的(95.01±3.67)%和(97.31±3.93)% (n=3)，黄芩苷降解残存率为(94.44±5.41)%和(96.40±3.71)% (n=3)，肠灌流实验为105 min，可认为柴胡皂苷a和黄芩苷在实验过程中基本稳定。为了保证数据的准确性，肠灌流液应现配现用，灌流后收集的样品应立即冷冻保存或用甲醇稀释，以免柴胡皂苷a和黄芩苷降解[8]。

2.4 肠壁和灌流管道吸附性考察 在37 ℃水浴条件下，离体大鼠小肠于药液中孵育2 h，柴胡皂苷a在含姜组与无姜组中所得药物浓度为原始药物浓度的(99.27±3.63)%和(98.73±3.71)%(n=3)，黄芩苷的药物浓度为原始药物浓度的(97.35±4.56)%和( 98.73±3.71)% (n=3)，可认为大鼠肠壁对药物的物理吸附、代谢或摄取作用不明显。

取蠕动泵的灌流管道，置于肠灌流液中，于37 ℃水浴中孵育2 h，柴胡皂苷a在含姜组与无姜组中所得药物浓度为原始药物浓度的 (97.05±4.31)%和(95.47±5.62)%(n=3)，而黄芩苷的药物浓度为原始药物浓度的(95.73±3.16)%和( 97.50±2.15)% (n=3)，各组0 h与2 h进行比较，均无显著性差异(P>0.05)，可认为灌流管道对药物的物理吸附作用不明显。为了保证数据的准确性，收集灌流液前应用K-R液充分冲洗肠道，避免肠内容对小柴胡汤中有效物质的吸附，灌流管道应于实验前后用K-R液充分清洗后再使用，避免柴胡皂苷a和黄芩苷在灌流管壁的残余对样品造成污染。

2.2.10 肠灌流液中吸收参数的测定 取适量小柴胡汤水煎液，用K-R液配制成肠灌流液。以回肠为灌流部位，采用大鼠在体单向肠灌流模型考察生姜对柴胡皂苷a和黄芩苷在肠道吸收的影响，结果见表1。由表1可知，含姜组小柴胡汤中柴胡皂苷a和黄芩苷在回肠的吸收均大于无姜组，且两组间存在显著性差异(P<0.05)，含姜组的Ka和Papp值均较无姜组增大了1.5倍，表明生姜对小柴胡汤中的柴胡皂苷a和黄芩苷肠道吸收可能有促进作用。

表1 生姜对小柴胡汤中柴胡皂苷a和黄芩苷吸收参数的影响

3 讨论

生姜在中药复方中广泛配伍使用，为探讨生姜在复方中的配伍意义及机理，本实验以经典复方小柴胡汤为例，从肠道吸收角度，考察配伍生姜对小柴胡汤水煎液中柴胡皂苷a和黄芩苷在肠道吸收的影响。

小肠是大多数口服药物主要的吸收部位, 预测药物小肠吸收的方法主要有离体法和在体法。在体法中大鼠单向肠灌流法(SPIP)因不损伤研究部位的循环系统和生理环境从而能够较好地模拟人体的体内环境，且结果与人体试验结果相关性良好[2-3]，目前在国内外得到了广泛的应用。灌流体积流量在一定程度上代表了肠道蠕动的生理状态，随着灌流体积流量的增加，肠道的吸收速率常数显著增加，说明肠道的蠕动加快会使药物吸收增加。人体肠灌流技术中多采用灌流液体积流量为2～3 mL/min，且人肠道直径约10倍于大鼠肠道直径[9]，故本实验大鼠单向灌流体积流量采用0.2 mL/min。

肠灌流实验中由于肠道对水分的吸收或分泌往往会导致灌流液体积随时间变化,现多选用酚红作为灌流液体积的“标示物”，然而，灌流过程中酚红往往也存在一定程度的肠吸收，且其本身还可能干扰某些化合物的肠道转运或分析测定[10]。与传统的酚红法相比，采用重量法对灌流液体积进行校正，能更直接真实地反映肠道吸收水分的实际情况，从而提高了Ka和Papp值的准确度[11]。

近年来的研究表明，肠道中真杆菌(E.SP.A-44)和双歧杆菌(S.SP.Saiko-2)能水解柴胡皂苷，并从其中分离到2种水解柴胡皂苷的酶，这2种糖苷酶分别是SHGasehe 和PHFase。大多数的柴胡皂苷经SHGasehe代谢为前柴胡苷元，再经PHFase代谢为柴胡皂苷元。柴胡皂苷元在肠道内被吸收进入血液中，故柴胡皂苷元是发挥药效的主要成分[12]。而真杆菌(E.SP.A-44)和双歧杆菌(S.SP.Saiko-2)主要存在于结肠，回肠中有少量分布。黄芩苷在体内的过程是先在胃肠道菌群作用下转化为黄芩素被吸收,然后在肠黏膜细胞内复原为黄芩苷[13-14]而进入体内，虽然水解黄芩苷的菌群多分布于盲肠和结肠，但回肠部同样有部分吸收[15]，由于结肠外富含脂肪组织，且结肠内含大量肠代谢物，故实验中难以对结肠段进行灌流，回肠段因肠道收缩性较好，易于取出冲洗，肠内容物较少等，故实验中选择回肠作为灌流肠段。

文献报道[16-17]，柴胡皂苷a和黄芩苷均为肠道不易吸收的物质，但与其他药物配对使用时，可明显增加药物在肠道吸收的量，在柴胡-芍药药对配伍中，柴胡皂苷a能促进芍药苷的肠道吸收，可能与柴胡皂苷能打开Caco-2细胞间的紧密连接有关[18]。本实验结果表明，在小柴胡汤复方水煎液柴胡皂苷a、黄芩苷在大鼠肠道的吸收速率常数(Ka)和表观吸收系数(Papp)均明显高于文献中对这两个物质单体肠吸收Ka、Papp数值，提示复方配伍应用可能促进了方中君药、臣药主要活性成分的小肠吸收。我们在前期实验中观察到，生姜的配伍对小柴汤中黄芩苷的溶出无影响，而对柴胡皂苷a的溶出有影响，且生姜降低小柴胡汤中柴胡皂苷a的含有量。而本实验重点考察生姜对小柴胡汤复方中柴胡皂苷a和黄芩苷肠吸收的影响。实验结果表明，在复方药物配比、煎煮方法、肠道吸收条件等因素不变的情况下，生姜的配伍与否明显影响了复方中主要活性成分柴胡皂苷a和黄芩苷在小肠的吸收，两者之间存在显著差异。配伍生姜能明显提高水煎液中这些活性成分小肠吸收速率及吸收量，提示小柴胡汤中配伍应用生姜的原理，除可能在于协调方中其他药物在药效上发挥作用外，还可能是因为生姜能促进方中君药、臣药主要活性成分的小肠吸收。生姜在其他复方中是否也存在同样的配伍作用，以及其促进吸收的机制有待进一步研究。

本实验从药物代谢动力学(如药物吸收、代谢)的角度研究复方配伍原理，不仅有助于深化了解中药配伍本质，还为中医药配伍理论研究提供新思路。

参考文献：

[1] 尤 强. 张仲景用姜规律探析[J].云南中医中药杂志，2003, 24(6): 45-46.

[2] Fagerholm U, Johansson M, Lennernas H. Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum[J].PharmRes, 1996, 13(9):1336-1342.

[3] Zakeri-Milani P, Valizadeh H, Tajerzadeh H,etal. Predicting human intestinal permeability using single-pass intestinal perfusion in rat[J].JPharmPharmSci, 2007, 10: 368-379.

[4] 陈 颖，杨 庆，邹丽娟. 黄连生物碱在大鼠在体单向肠灌流模型中的转运特性研究[J].中国中药杂志，2011，36(24):3523-3527.

[5] 潘德城，孙婷婷，孙勇兵，等.单向灌流法研究丹参提取物中丹参素和原儿茶醛大鼠肠吸收特性[J].中草药，2011，42(5)：944-950.

[6] 章佳赟，谢 晖，潘胜利. HPLC测定4种常用柴胡剂中柴胡皂苷a的含量[J].中成药，2010，32(1)：81-83.

[7] 周逸芝，刘训红，许 虎，等.HPLC法同时测定龙柴方及其组方药材黄芩中4种黄酮[J].中成药，2013，35(5)：978-981.

[8] 于波涛，张志荣，刘文胜，等. 黄芩苷稳定性研究[J].中草药，2002，33(3)：218-220.

[9] Zakeri-Milani P, Valizadeh H, Tajerzadeh H,etal. Predicting human intestinal permeability using single-pass intestinal perfusion in rat[J].JPharmPharmSci, 2007, 10(3): 368-379.

[10] 胡一桥,郑梁元,钱陈钦,等.离子型药物酚红的小肠吸收研究[J].中国药科大学学报, 1996，27(6): 355-359.

[11] 聂淑芳,潘卫三,杨星钢,等.对大鼠在体肠单向灌流技术中重量法的评价[J]. 中国新药杂志，2005，14(10):1176-1179.

[12] 夏小燕,居文政,谈恒山.肠道菌群对中药皂苷类成分的代谢研究进展[J]. 中国中医药信息杂志，2008，15(2):96-97.

[13] Akao T , Kawabata K, Yanagisawa E,etal.Baicalin, the predominant flavone glucuronide of scutellariae radix, is absorbed from the rat gastrointestinal tract as the aglycone and restored to its original form[J].JPharmPharmacol,2000,52(12) : 1563-1568.

[14] Xing J, Chen X Y, Zhong D F. Absorption and enterohepatic circulation of baicalin in rats[J].LifeSci, 2005, 78(2): 140-146.

[15] 刘太明,蒋学华. 黄芩苷和黄芩素大鼠在体胃、肠的吸收动力学研究[J].中国中药杂志,2006，31(12)：999-10001.

[16] 祝婧云,梁新丽，王光发，等.白芷提取物对黄芩活性成分黄芩苷的吸收促进作用[J].药学学报,2011，46(2)：232-237.

[17] 刘史佳.柴胡皂苷a 的药动学及药物相互作用研究[D].南京：南京中医药大学，2010．

[18] 陈 彦，王晋艳，辛 然，等. 柴胡皂苷对芍药苷在Caco-2 细胞模型中吸收转运的影响[J].中国中药杂志,2012，37(12)：1850-1854.