兽医实验室ELISA检测中应注意的问题

曲百友 王剑

兽医实验室ELISA检测中应注意的问题

曲百友 王剑

（山东省邹平县畜牧兽医局 256200）

由于酶联免疫吸附测定ELISA具有样品前处理简便快速准确所需仪器廉价等优点已广泛应用于免疫学检验的各领域中，也是兽医免疫学检验中最为常用的方法，基层兽医实验室免疫学检验的主要检测内容包含猪瘟抗体、蓝耳病抗体、口蹄疫(O型，A型，亚洲I型)抗体。其中口蹄疫三种亚型液相阻断ELISA抗体检测的量最大，检测程序最复杂。笔者在工作中体会到ELISA法检测的质量控制很重要，正确的操作方法是保证ELISA检测结果准确的必要条件。现将操作中常出现的问题报告如下：

1 动物采血和样本处理

一般在医学免疫检验中均以血清作为检测标本。牛羊一般采用颈静脉采血，猪一般采用耳静脉采血。采集中应注意动作轻柔，避免溶血，因红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质影响，检测结果。标本储存时间过长，IgG可能会聚合成多聚体，在间接ELISA测定中导致本底过深，甚至造成假阳性。一般在5d内测定的血清标本可放置于4℃箱中，超过1周测定的需低温冰存。

2 回温

常用的试剂盒说明书中都提到低温储存使用前恢复到室温但对室温并没有明确规定。经验证明日常的20~ 25℃的室温并不十分适合，因为较高的温度对于操作者尤其是生手会使孔与孔之间产生很大的差别，影响结果。因此采用尽量低的温度。具体温度以洗涤液中的结晶通过充分的振摇能够完全溶解为准。

3 加样

在ELISA中操作最多的是加样，涉及每一步骤。目前加样一般都使用微量加样器，按规定的量加入板孔中。加样时首先注意应将所加物加在板孔底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。在加入不同物质时应更换吸嘴，以免发生交叉污染。另外，在显色时，最好使用多道微量加样器，使加液过程迅速完成，因为显色对时间的要求较高，最好是同一时间显色，加样时间越统一，结果误差越小。特别是在口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒使用中。加样及倍比稀释的时间越长结果偏差越大。

4 孵育

抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。ELISA法一般采用37℃恒温，可将ELISA板置于恒温箱中。为避免蒸发，一定要用封板条封住反应孔。反应板均不叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。

5 洗涤

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技，应引起操作者的高度重视。

5.1 血液凝固不全引起的假阳性 血液凝固不全时有纤维吸附现象，致使洗板不净，残留的非固相酶产生的非特异性显色影响结果，而且这种显色很深易误认为强阳性。

5.2 洗液 洗液要临用前新鲜配制，放置时间过长易产生絮状物或混浊，造成赌孔或花板。使用洗板机时候要注意设置好洗板液量和间隔时间。

5.3 拍板 有些ELISA过程中需要拍掉残余的水分，应在吸水纸上轻轻拍打，次数不宜过多。如果手重容易拍掉包被的抗原或抗体。造成结果不准。

6 比色与结果判定应注意的问题

显色后一定要在规定时间内用酶标仪进行读取。

7 保护

ELISA法检测在传染性疾病的诊断中应用很广泛，特别是基层实验室，同时OPD及TMB也均有致癌性。所以加强ELISA法的全程质量控制和重视操作中的一些安全问题对检测结果的准确性和检测人员安全性非常重要。应针对每项操作建立完善的标准操作规程，加强对检验人员的统一管理，严格按操作规程进行操作，确保检测人员安全性。

（2014–04–14）

S851.2+1

C

1007-1733(2014)05-0066-01