HPLC法测定獐芽菜苦苷含量及有关物质

李大亮 张 辉 吕文博

(1.黑龙江生态工程职业学院，黑龙江 哈尔滨150025；2.哈尔滨药业股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 150025)

HPLC法测定獐芽菜苦苷含量及有关物质

李大亮1张 辉2吕文博1

(1.黑龙江生态工程职业学院，黑龙江 哈尔滨150025；2.哈尔滨药业股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 150025)

目的：为更好地控制产品质量，建立獐芽菜苦苷含量及有关物质检查方法。方法：采用高效液相色谱法，有关物质检查方法进行专属性、溶液稳定性及检测限方法验证，采用含量测定方法进行溶液稳定性、线性、准确度、精密度、重复性方法验证试验。结果：方法验证结果表明所建立方法可行。结论：所建立方法可有效控制产品质量。

HPLC法；獐芽菜；苦苷；含量；有关物质；方法验证

獐芽菜苦苷为獐芽菜中主要成分，因其药理作用广泛，越来越受到人们关注，市场上出现以獐芽菜苦苷为主要成分的制剂，如何控制獐芽菜苦苷制剂产品质量，显得尤为重要。通过相关研究建立獐芽菜苦苷含量及有关物质检查方法。

1 材料与仪器

獐芽菜苦苷对照品 来源：哈尔滨药业股份有限公司

Agilent 1260高效液相色谱仪 厂家：安捷伦科技有限公司

色谱柱：Venusil XBP C18 4.6*250mm，5μm 厂家：天津博纳艾杰尔科技有限公司

2 有关物质检查

2.1 有关物质检查方法筛选

参照相关文献[1，2],对獐芽菜苦苷有关物质检查方法进行筛选，流动相选择甲醇及水进行筛选，根据杂质分离情况，确定流动相比例，同时进行相关方法验证。

2.2 耐用性试验

通过对不同厂家的色谱柱进行筛选，结果Venusil XBP C18对杂质分离最好，当甲醇∶水为30∶70时，各杂质峰与主峰可有效分离。变换柱温，改变流速，改变流动相比例，考察杂质检出情况，结果改变柱温、流速、流动相比例，杂质与主峰分离度符合规定，杂质检出量基本一致。

2.3 溶液稳定性试验

取獐芽菜苦苷原料，加流动相制成0.25mg/ml溶液，分别于0、2、4、6、8h测定。结果供试品溶液在4h时杂质增加较明显，供试品溶液配制后在4h内进样。

2.4 检测限

取獐芽菜苦苷对照品，制成不同浓度溶液，进样，以信噪比约为3∶1为检测限。结果本品检测限溶液浓度为27ng/ml(信噪比为2.8)，供试品浓度与检测限浓度比值约为8 000，溶液浓度可行。

2.5 专属性

考察供样品在酸、碱、氧化、高温及强光条件下稳定性，DAD检测器全波长监测，为确定检测波长提供依据，评价在各条件下稳定性及可能降解产物。结果獐芽菜苦苷样品破坏前后峰纯度均符合规定(DAD监测)，说明主峰与杂质峰可有效分离。各波长监测结果表明在230nm波长处为最佳检测波长。

2.6 已知杂质研究

专属性试验中发现有一杂质超过0.1%，初步分析该杂质为獐芽菜苷，取獐芽菜苷对照品进样，结果表明该杂质为獐芽菜苷。分别取獐芽菜苦苷及獐芽菜苷对照品，配制不同浓度溶液5份，分别进样，根据标准曲线斜率之比，计算二者相对响应因子，结果獐芽菜苷与獐芽菜苦苷相对响应因子为0.73。

2.7 有关物质检查

色谱条件与系统适用性实验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Venusil XBP C18)；以甲醇—水(30∶70)为流动相；检测波长为230nm。理论板数按獐芽菜苦苷峰计算应不低于5 000。取供试品加流动相制成0.25mg/ml溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液1ml于100ml，加流动相至刻度，作为对照溶液。取供试品及对照溶液进样，獐芽菜苷不得过0.5%，单一杂质不得过0.1%，总杂质不得过1.0%。

取供试品按照确定方法检查，结果獐芽菜苦苷为0.16%，单一未知杂质0.03%，总杂质0.31%。峰纯度监测符合规定。所建立有关物质检查方法可行，可以有效控制产品质量。

3 含量测定

3.1 方法及色谱柱

供试品溶液浓度及流动相与有关物质检查方法相同，色谱柱Venusil XBP C18 4.6*250mm，5μm，厂家：天津博纳艾杰尔科技有限公司。

3.2 系统适用性试验

取獐芽菜苦苷对照品加流动相溶解制成0.25mg/ml溶液作为对照品溶液，精密量取对照品溶液10μl,重复进样6次。结果重复进样6次，主峰相对标准偏差为0.2%，保留时间相对标准偏差为0.5%，符合规定。

3.3 耐用性试验

取对照品及供试品，按照拟建立方法通过改变流动相比例、流动相pH值、柱温、流速及更换色谱柱(相同品牌，不同批号)考察分析方法本身偏差的影响，结果各条件微小变化含量测定结果偏差均符合规定，同时各条件下分离度及对称因子均符合规定，塔板数较高，耐用性试验符合要求。

3.4 线性试验

精密称取獐芽菜苦苷对照品，制成不同浓度的溶液，分别测定其主峰的面积。以溶液浓度为横坐标(X)，主峰峰面积为纵坐标(Y)，结果线性试验符合要求。

3.5 溶液稳定性试验

取供试品加水制成0.25mg/ml的溶液，分别于0、1、2、3、4h测定溶液峰面积，溶液在4h含量下降约0.5%，供试品溶液比较稳定。

3.6 重复性试验

精密称取供试品，配制6份相同浓度溶液，进样，结果6份相同浓度样品测定结果的相对标准偏差为0.3%，符合要求。

3.7 中间精密度试验

在不同时间由不同分析人员使用不同仪器进行试验，精密称取供试品溶液，配制6份相同浓度溶液，进样，计算12次试验测定结果相对偏差，结果12次测定结果的相对标准偏差为0.6%，中间精密度符合规定。

3.8 准确度试验

配制浓度为80%、100%和120%的供试品溶液各三份，采用加入法测定回收率，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。

对照品溶液制备：精密称取獐芽菜苦苷对照品2份，分别于25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液制备：精密称取獐芽菜苦苷样品2份，分别于50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，测定供试品含量为99.3%。

供试品溶液Ⅰ制备(80%)：分别精密称取獐芽菜苦苷供试品及獐芽菜苦苷对照品于25ml量瓶中，加水稀释至刻度，平行制备3份。

供试品溶液Ⅱ制备(100%)：分别精密称取獐芽菜苦苷供试品及獐芽菜苦苷对照品于25ml量瓶中，加水稀释至刻度，平行制备3份。

供试品溶液Ⅲ制备(120%)：分别精密称取獐芽菜苦苷供试品及獐芽菜苦苷对照品于25ml量瓶中，加水稀释至刻度，平行制备3份。

取上述溶液按照含量测定方法进行测定，计算回收率，结果平均回收率为99.3%、99.6%、100.1%，相对标准偏差为0.2%，准确度试验符合要求。系统适用性、耐用性、线性、重复性、溶液稳定性、中间精密度及准确度试验结果表明含量测定方法可行。

3.9 含量测定

取样品，按确定的含量测定方法测定，结果分别为99.8%、99.6%、99.4%。

4 结论

本文对獐芽菜苦苷有关物质及含量检查方法进行验证，方法学验证结果表明所建立方法可行，并对样品中已知杂质进行研究，并制定合理限度，所建立方法可以有效控制产品质量。

[1]贾珍,杨凤梅.高效液相色谱法测定藏茵陈注射液中獐芽菜苦苷的含量[J].中国现代应用药学,2007，24(5):392～393.

[2]包同力嘎.HPLC法测定不同产地肋柱花中獐芽菜苦苷的含量[J].辽宁中医杂志,2013，40(12):2 558～2 559.

责任编辑：桑咏梅

10.3969/j.issn.1674-6341.2014.04.011

2014-05-08

李大亮(1981-)，男，黑龙江哈尔滨人，讲师，硕士。研究方向：中药有效成分提取与分离。

R927.2

A

1674-6341(2014)04-0023-02