乙醇沉淀法对头花蓼水提物活性成分和抗氧化活性的影响研究

龚金炎， 陈丽春， 张 蕾， 葛 青， 毛建卫， 黄 俊， 刘士旺， 王永江

（1.浙江科技学院生物与化学工程学院， 浙江 杭州 310023； 2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室， 浙江 杭州 310023； 3.浙江大学生物系统工程与食品科学学院， 浙江 杭州 310029； 4.绍兴市质量技术监督检测院， 浙江 绍兴 312000）

乙醇沉淀法对头花蓼水提物活性成分和抗氧化活性的影响研究

龚金炎1，2，3，4， 陈丽春1，2， 张 蕾1，2， 葛 青1，2， 毛建卫1，2， 黄 俊1，2， 刘士旺1，2， 王永江1，2

（1.浙江科技学院生物与化学工程学院， 浙江 杭州 310023； 2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室， 浙江 杭州 310023； 3.浙江大学生物系统工程与食品科学学院， 浙江 杭州 310029； 4.绍兴市质量技术监督检测院， 浙江 绍兴 312000）

目的 研究乙醇沉淀法对头花蓼水提物活性成分和抗氧化活性的影响。 方法 70%乙醇醇沉后， 分别采用分光光度法测定总黄酮、 总酚和 HPLC法测定没食子酸的量， 采用 DPPH和 ABTS 法测定抗氧化活性。 结果 醇沉后， 头花蓼活性成分富集明显，抗氧化活性明显增强。结论 醇沉有助于头花蓼活性成分富集和抗氧化活性的提升。

头花蓼；醇沉；总黄酮；总酚酸；抗氧化性

头花蓼为蓼科植物头花蓼 Polygonum capitatum Buch—Han.ex D.Don 的干燥全草或地上部分， 主要分布在贵州、云南、四川、江西、湖南、湖北等地，为著名的贵州苗药之一［1］。 民间常用头花蓼治疗泌尿系统感染、 血尿、湿疹、肾盂肾炎、膀胱炎、尿路结石、风湿痛、疮疡、腹泻、 痢疾等症， 对泌尿系统有独特疗效［2］。 以头花蓼为主要原料的热淋清胶囊、热淋清颗粒在临床上用于治疗泌尿系统感染， 分别被 《中华人民共和国卫生部药品标准》 中药成方制剂第十二册及2010 年版 《中国药典》 收载。 热淋清胶囊、热淋清颗粒以头花蓼水提物作为主要原料，因此，在临床中每天的服药量较大。大量文献表明没食子酸为头花蓼及其制剂的主要有效成分之一［3-4］， 抗菌消炎、 抗氧效果显著［5］， 目前作为热淋清颗粒的定量监控指标［6］。 水提醇沉法是中药制剂生产中常用的提取精制方法，能除去蛋白质、 多糖、 鞣质等杂质， 富集有效成分［7］。 目前已成为中药制剂生产中的通用工艺［8］。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 头花蓼水提物 （浙江天昊药业有限公司提供批号 20100802）； 芦丁对照品 （中国药品生物制品检定所， 纯度≥95%）； 没食子酸对照品 （中国药品生物制品检定所， 纯度≥99%）； ABTS 试剂 （东京仁成工业株式会社）； DPPH试剂 （梯希爱 （上海） 化成工业发展有限公司）； 色谱级甲醇 （天津市四友精细化学品有限公司）； 色谱级乙腈 （西班牙萨劳 Scharlau 有限公司）； 纯净水 （杭州娃哈哈集团有限公司）；无水乙醇，亚硝酸钠， 硝酸铝， 过硫酸钾，氢氧化钠均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备 可见分光光度计 （721G）， 上海精科仪器有限公司； 微型漩涡混合仪 （ XW-80A）， 上海沪西分析仪器厂有限公司； 数显鼓风干燥箱 （ GZX-9070MBE），上海博迅实业有限公司医疗设备厂； BS124S 电子天平， 赛多科斯科学仪器 （北京） 有限公司； 高效液相色谱， 美国Waters公司， 美国 Waters2695， 配置 PDA 2996 检测器。

2 实验方法

2.1 原料预处理 头花蓼棕褐色水提物粉末 50 g， 溶解于900 mL水中， 加入 2.1 L无水乙醇， 常温下醇沉 48 h，4 000 r/min 离心 30min［9］； 上清液旋转蒸发至浸膏状， 真空冷冻干燥， 得到头花蓼水提乙醇溶解物 16.05 g； 将下层沉淀放置在蒸发皿中，在水浴锅上去除乙醇，冷冻干燥后，得到头花蓼水提乙醇沉淀物 27.37 g。

2.2 芦丁标准曲线的绘制与总黄酮的测定 准确称取干燥至恒定质量的芦丁对照品 15.0 mg， 甲醇溶解并定容至100 mL， 配成 0.15 mg/mL的芦丁对照溶液。 取 0、 0.5、1.0、 2.0、 3.0 和4.0mL标准溶液， 加入30%乙醇溶液至5 mL， 加入 5%亚硝酸钠溶液 0.3 mL， 混匀后放置 5 min，加入 10%硝酸铝溶液 0.3 mL， 混匀后放置 6 min， 加入1.0mol/L氢氧化钠溶液 4mL， 用 30%乙醇定容至 10mL，放置 10 min， 以零管为空白， 摇匀后用 1cm的比色杯， 在510 nm的波长处测定吸光度， 以芦丁质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 y=0.010 2x+0.005 8；r2=0.999 4。

分别准确称取 3 种提取物各 100 mg， 30%乙醇溶解并定容至 100 mL， 取 1 mL的待测液， 按标准曲线方法测定吸光值，并根据标准曲线计算试样的总黄酮的量。

2.3 没食子酸标准曲线的绘制与总酚的测定 准确称取经干燥至恒重的没食子酸对照品15.4mg， 30%乙醇溶液溶解并定容至 100 mL， 配成 0.150 mg/mL标准溶液。 取 0.05、0.10、 0.15、 0.20、 0.25 和 0.30 mL标准溶液， 用水稀释至 5.0mL， 各加入 0.5 mL未稀释的福林试剂， 混匀后静置 8 min， 加入 1.50 m L 20%Na2CO3水溶液， 室温暗处静置 2 h， 以零管为空白， 用 1 cm的比色皿在 765 nm的波长处测定吸光度，以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标 绘 制 标 准 曲 线。 y=0.136 3x+0.214 7， r2= 0.999 5。

分别准确称取 3 种提取物各 100 mg， 30%乙醇溶解并定容至 100mL， 取 0.1 mL的测试样品， 按标准曲线的方法测定吸光值，并根据标准曲线计算试样的总酚的量。

2.4 没食子酸检测的色谱条件与标准曲线的建立 色谱柱为 Luna C18柱 （250 mm×4.60 mm， 5 μm）； 流动相为乙腈-1%乙酸 （5 ∶95）； 体积流量 1.0 mL/min； 柱温 25 ℃；检测波长 272 nm； 进样量 10μL； 在此条件下没食子酸与其他组分能达到基线分离，如图1所示。

图1 头花寥中没食子酸色谱图

精密称取没食子酸 100.8 mg， 用甲醇溶解并定容至100 mL， 摇 匀， 即 得 没 食 子 酸 对 照 品 贮 备 液（1.008mg/mL）。 分别精密量取上述对照品贮备液， 以甲醇为溶剂， 配制成没食子酸质量浓度分别为 1.008、 2.016、4.032、 8.064、 10.08、 20.16、 40.32、 60.48， 80.64 和201.6 μg/mL的溶液。 用高效液相色谱进行测定， 分别平行进样 3 次。 没食子酸在 0.010 08 ～2.016 μg与峰面积呈现良好的线性关系， 回归方程为 y=32 778x+8 800， r2= 0.999 9。

2.5 抗氧化活性的测定

2.5.1 ABTS 法［10］取 176 μL 140 mmol/L过硫酸钾溶液和 10mL 7 mmol/L ABTS 贮备液混合， 在室温条件下避光储备 12 ～16 h。 用无水乙醇将 ABTS+溶液稀释至吸光度值为 0.700 ±0.02 （734 nm）， 将 3.9 mL的 ABTS+溶液与0.1 mL待测液 溶 液 混 合 摇 匀， 在室温下 反 应 6 min， 在734 nm波长下测定吸光值， 以 50%的甲醇为空白对照。 以上实验重复3 次。 根据下列公式计算每种待测样品对 ABTS自由基的清除率： 抑制率（%） =（A空白-A样品） /A空白×100%

2.5.2 DPPH法［11］准确称取 DPPH试剂 20 mg， 用无水乙醇溶解至 500mL量瓶中， 摇匀得 0.101mmol/L的 DPPH溶液。 取待测样溶液 0.1 mL和 3.9 mL DPPH溶液混合摇匀， 在室温下反应 1 h， 在 517 nm波长下测定吸光度， 以50%的甲醇为空白对照。 根据下列公式计算每种待测样品对 DPPH自 由 基 的 清 除 率： 抑 制 率 （%） = （A空白-A样品） /A空白×100%

3 结果分析

3.1 醇沉前后总黄酮、 总酚和没食子酸的变化 如表 1 所示，醇沉后，无论是总黄酮、总酚还是没食子酸的量都升高， 其中没食子酸的量上升明显， 升高了 156%。

表1 醇沉前后总黄酮、总酚和没食子酸的变化

3.2 抗氧化活性 ABTS 法测定结果 由图 2 可知， 在相同质量浓度时， 头花蓼水提乙醇溶解物对 ABTS 自由基的清除能力最强，头花蓼水提物其次。在试验的质量浓度范围内，三者的抑制率均随质量浓度的升高而增大，头花蓼醇沉后， 清除 ABTS 自由基的活性明显增强。

图2 醇沉前后样品对 ABTS自由基的清除作用

3.3 抗氧化活性 DPPH法测定结果 由图 3 可知， 在相同质量浓度时， 头花蓼水提乙醇溶解物对 DPPH自由基的清除能力最强，头花蓼水提物其次。在试验的质量浓度范围内，三者的抑制率均随质量浓度的升高而增大，头花蓼醇沉后， 清除 DPPH自由基的活性明显增强。

图3 乙醇沉淀前后样品对 DPPH自由基的清除作用

4 讨论

本实验研究了醇沉对头花蓼水提物的活性成分和抗氧化活性的影响，通过测定总黄酮、总酚和没食子酸的量来判断醇沉对头花蓼活性成分的影响， 通过测定 ABTS 和 DPPH自由基的清除能力， 来判断醇沉对头花蓼抗氧化活性的影响。

实验结果表明醇沉对头花蓼水提物的活性成分和抗氧化活性均有较大程度的提高，其中头花蓼及其制剂中的主要活性成分没食子酸的量上升最为明显， 提高了 156%。热淋清胶囊、热淋清颗粒以头花蓼水提物作为主要原料。在临床中，每天的服药量较大。因此，采用水提后醇沉的方法能有效地除去头花蓼水提物中蛋白质、多糖、鞣质等杂质［12-13］， 富集没食子酸等有效成分， 达到减量不减效的目标。

［1］ 陈欣霞，张丽艳，万金志，等.高速逆流色谱同时分离头花蓼中的没食子酸和短叶苏木酚酸［J］.中国中药杂志，2010， 35（15）： 1957-1960.

［2］ 王洪平，曹 芳，杨秀伟.头花蓼地上部分的化学成分研究［ J］.中草药， 2013， 44（1） ： 24-30.

［ 3 ］ 王祥培， 万德光， 王 强， 等.HPLC测定不同产地的头花蓼中没食子酸的含量［ J］.华西药学杂志， 2007， 22（2）：204-205.

［ 4 ］ 吴 居， 王德仁.石莽草化学成分的研究［J］.中草药，1985， 16（4）： 5-6.

［ 5 ］ 王 爽， 张丽艳， 谢 宇， 等.HPLC测定头花蓼及制剂热淋清颗粒中没食子酸的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2012， 18（9）： 112-115.

［6］ 刘志军，戚 进，朱丹妮，等.头花蓼化学成分及抗氧化活性研究［J］.中药材， 2008 ， 31（7）： 995-998.

［7］ 何 雁，辛洪亮，黄 恺，等.水提醇沉法中醇沉浓度对板蓝根泡腾片制备过程的影响［J］.中国中药杂志， 2010， 35（3）： 288-292.

［8］ 杜 松，罗爱勤，刘美凤.中药浸膏醇沉工艺中醇浓度概念与计算方法辨析［ J］.中草药， 2012， 43（8） ： 1652-1655.

［ 9 ］ 马顺英.水提醇沉对茵陈中绿原酸提取率的影响［J］.首都医药， 2012， 19（20）： 56.

［10］ Re R， Pellegrini N， Proteggente A， et al.Antioxidant activity applying an improved abts radical cation decolorization assay［J］ .Free Radical Bio Med， 1999， 26（9） ： 1231-1237.

［11］ Sharma O P， Bhat T K.DPPH antioxidant assay revisited［ J］. Food Chem， 2009， 113（4）： 1202-1205

［12］ 俞 翔， 莫必琪， 王 治， 等.丹参醇沉过程中丹参素、 丹酚酸 B和丹酚酸 D的回收率预测研究［J］.中草药， 2010，41（6）： 900-903.

［13］ 张 寒， 闫安忆， 龚行楚， 等.丹参注射液生产中一次醇沉上清液浓缩工艺质控指标研究［J］.中国中药杂志， 2011，36（11）： 1436-1440.

R284.1

： B

： 1001-1528（2014）05-1072-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.044

2013-04-12

国家自然科学基金资助项目 （31240054）； 国家十二五科技支撑计划资助项目 （2011BAD23B02）； 浙江省自然科学基金资助项目 （Q13C200006）； 浙江省大学生科技创新活动计划项目 （2013R415015）； 浙江省重点科技创新团队资助项目 （2011R09028-12）

龚金炎 （1982—） ， 男， 博士， 副教授， 研究方向： 天然产物与功能性食品的研究与开发。 E-mail： gongjinyan1982@163.com