HPGPC-ELSD法检测注射用益气复脉 （冻干） 中糖苷类大分子物质

彭 菲， 叶正良， 李德坤， 杨悦武， 周大铮

（1.天津中医药大学， 天津 300193； 2.天津天士力之骄药业有限公司， 天津 300410）

HPGPC-ELSD法检测注射用益气复脉 （冻干） 中糖苷类大分子物质

彭 菲1， 叶正良2*， 李德坤2， 杨悦武2， 周大铮2

（1.天津中医药大学， 天津 300193； 2.天津天士力之骄药业有限公司， 天津 300410）

目的 建立 HPGPC-ELSD法检测注射用益气复脉 （冻干） 中糖苷类大分子物质 （杂质） 的限量方法。 方法采用 ELSD为检测器， Ultrahydrogel250 色谱柱 （7.8mm×300mm）， 以甲酸-水 （1 ∶5 000） 为流动相， 建立大分子物质 （杂质） 的液相测定方法， 并对 10 批注射用益气复脉 （冻干） 进行了糖苷类大分子物质的检测。 结果 10 批注射用益气复脉 （冻干） 中均无糖苷类大分子物质。 结论 此方法简便、 快捷和灵敏， 可用于注射用益气复脉 （冻干）中糖苷类大分子物质的检查，具有一定的实用意义。

HPGPC-ELSD； 注射用益气复脉 （冻干）； 大分子物质检测

注射用益气复脉 （冻干） 为中药保护品种， 由红参、麦冬、五味子三味药材经提取纯化后制成的制剂，具有益气复脉，养阴生津功能。临床上主要用于预防和主治冠心病、心绞痛及合并心功能不全或心源性休克等。注射用益气复脉 （冻干） 中主要成分为糖类、 皂苷类、 木脂素类等； 其中主要活性成分为皂苷类和木脂素类［1-4］， 其相对分子质量大多数不超过 1 000。 而处方药材中相对分子质量较大的物质如蛋白质、多肽、多糖等在提取和制剂工艺过程中是作为杂质而去除的物质。本研究正是基于上述情况，建立了高效凝胶渗透液相色谱-蒸发光散射检测法并对注射用益气复脉 （冻干） 中可能存在的糖苷类大分子物质进行检测，结果令人满意。

1 仪器和试药

Waters2695 高效液相色谱仪， Waters 2420 型蒸发光散射检 测 器， Waters UltrahydrogelTM250 凝 胶 色 谱 柱 （ 7.8 mm×300 mm）， XWK-3A空气泵 （ 天津市华生分析仪器厂）， XS105 梅特勒精密电子分析天平 （上海梅特勒-托利多仪器上海有限公司）； 右旋糖苷分子量对照品由中国药品生物制品检定所提供 （批号 140640-201002， 相对分子质量为 180， 2 500， 4 600， 7 100， 10 000， 21 400， 41 100，84 400）， 注射用益气复脉 （冻干） 由天津天士力之骄药业有限公司提供，超纯水自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为 Waters UltrahydrogelTM250 凝胶色谱柱 （7.8 mm×300 mm）； 柱温 30 ℃； 流动相为甲酸-水（1 ∶5 000）； 体积流量 0.5 mL/min。 检测器参数： 飘移管温度 90 ℃， 气压 0.17 MPa； 进样量 20 μL。

2.2 分子量标记物保留时间考察 精密称取上述 9 份对照品适量， 用超纯水配制成各约 1 mg/mL的溶液， 同时水作空白对照溶液，按上述色谱方法，分别进样，测定，图谱见图 1， 保留时间见表 1。

图1 8种不同相对分子质量右旋糖酐对照品及空白对照品的 HPGPC图

从表 1 结果可知， 保留时间大于 16 min 的均为小分子物质， 故保留时间在 16 min 内的可初步推测其为大分子物质。

表1 8种不同相对分子质量右旋糖酐对照品的保留时间

2.3 精密度 考察 精密称 量相对 分 子质量为 2 500、4 600、 10 000 和 41 100 的右旋糖酐对照品， 分别用水稀释至刻度， 得质量浓度为 1.18、 1.24、 1.32、 1.36 mg/mL的溶液， 分别连续进样6 次， 测定保留时间， 计算 RSD， 结果相对分子质量为 2 500、 4 600、 10 000 和 41 100 的右旋糖酐对照品和保留时间的 RSD分别为 0.106 2%、 0.309 3%、0.307 7%和 0.271 7% （n=6）， 表明精密度良好。

2.4 最低检 出限 精密称 取相对 分 子质量为 2 500、4 600、 10 000 和 41 100 的右旋糖酐对照品， 分别用水稀释至刻度， 得质量浓度为 2.16、 2.25、 2.08、 2.44 mg/mL的溶液， 分别稀释至 20 倍、 50 倍、 100 倍、 200 倍、 500 倍，进样分析。 结果表明， 二者在稀释到 500 倍时， 样品峰的S/N分别为 7.52、 3.13、 4.21 和 3.37， 故可判断右旋糖苷对照品的最低检出限约为 4 μg/mL。

2.5 稳定性考察 取上述两种右旋糖酐对照品溶液， 分别放置 0、 2、 4、 8 h 后按上述条件进样测定， 计算保留时间的 RSD， 结果相对分子质量为 2 500、 4 600、 10 000 和41 100的 右 旋 糖 酐 对 照 品 的 保 留 时 间 的 RSD 分 别 为0.101 3%、 0.126 0%、 0.351 4%和 0.223 7% （n=4），结果表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.6 样品测定 分别取 10 批注射用益气复脉 （冻干） 用超纯水配制成质量浓度约为 100 mg/mL的溶液， 摇匀， 经0.45 μm微孔滤膜过滤， 取续滤液， 进样 20 μL测定。 样品HPGPC图见图 2。

结果表明所测 10 批注射用益气复脉 （冻干） 样品的出峰时间均高于 16 min， 可判断样品中无糖苷类大分子物质或含有量极低在此检测方法灵敏度以下。

2.7 样品稳定性考察 精密称取注射用益气复脉 （冻干）， 用水溶解并定容至100 mg/mL。 分别考察在0、 2、 4、8 h放置后样品在水溶液中的稳定性。 所得 HPGPC图见图3。

结果表明：样品溶解于水溶液中后在8 h内测定没有出现大分子物质，因此样品在水溶液中8 h内稳定性良好。

3 分析与讨论

3.1 目前， 对于中药注射剂中的大分子物质的检测尚无法规性方法可作参考， 且相关文献报道较少［3-8］。 本研究中的方法学验证是参照 《中国药典》 2010 年版一部附录XⅧ中药质量标准分析方法验证基本要求进行的。

图 2 10 批 注 射 用 益 气 复 脉 （冻 干） 的 HPGPCELSD图

图3 样品在水溶液中的稳定性

3.2 结合注射用益气复脉 （冻干） 中的各类化学成分所占的比例的研究结果：其中总糖量在制剂中的比例较高［3］， 故本 研 究 选 用 右 旋糖 苷 不 同 相 对 分 子 质 量 对 照品［9-10］为标记， 来建 立检测方法， 用于检测 制 剂 中可能存在的糖苷类大分子物质。

3.3 依据凝胶色谱的分离原理 相同实验条件下， 物质的相对分子质量越大，越不易进入凝胶空隙，保留时间越短；反之相对分子质量越小， 保留时间越长［11］。 基于这一原理建立此方法对中药注射剂生产工艺过程中的大分子物质进行检 测， 简 便 易 行。 并 通 过 对 Ultrahydrogel 250 色 谱 柱（7.8 mm×300 mm） 和 Ultrahydrogel 500 色谱柱 （7.8 mm× 300mm） 的适用性进行对比， 选用 Ultrahydrogel 250 色谱柱（7.8mm×300mm） 来建立方法。 蒸发光散射检测器设计用于高效液相色谱系统，较之前所利用示差折光检测器所建立的方法［9］更有优势， 此方法不仅稳定性更高， 精密度更好，而且灵敏度也有提高， 最低检出限 （以右旋糖酐计） 约为4 μg/mL。 此外， 蒸 发 光 散 射 检 测 器 可 以 用 于 梯 度 洗脱［12-13］， 较示差折光检测器更便于进一步优化开发新方法，适用范围更广。

3.4 此方法选用甲酸-水 （1 ∶5 000） 为流动相 pH约为3.0， 经考察用此流动能够排除皂苷类和木脂素类成分因物理聚合形 式 聚 集 物［14-15］而 对 大分 子 物 质 测 定 结 果 产 生 干扰。 样品测定时选用样品质量浓度约为 100 mg/m L， 即取本品 1 瓶， 加注射用水 2.6 mL使溶解； 与 RID检测方法［4］相比既明显增大了样品质量浓度，提高检测样品中糖苷类大分子物质的灵敏度，又与注射用益气复脉 （冻干） 质量标准检查项中杂质检测的质量浓度相一致。

本研究采用 HPGPC-ELSD检测注射用益气复脉 （冻干）中糖苷类大分子物质，操作简便、结果可靠且灵敏度更高。因此，本方法可作为益气复脉 （冻干） 的质量控制方法。也可为其他中药制剂中大分子物质的检测提供参考。

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2013-04-15

国家 “重大新药创制” 科技重大专项 （2010ZX09502-004）

彭 菲 （1989—）， 女， 硕士生， 研究方向： 药物分析与质量控制。 Tel： 13302193298

*通信作者： 叶正良， 男， 研究员。 Tel：（022）26732066， E-mail： yezl@tasly.com