高效液相色谱-二极管阵列法同时测定三黄血清口服液中 5 个成分

张 平， 俞永梅， 储忠英

（上海市松江食品药品检验所， 上海 201600）

高效液相色谱-二极管阵列法同时测定三黄血清口服液中 5 个成分

张 平， 俞永梅， 储忠英

（上海市松江食品药品检验所， 上海 201600）

目的 建立 HPLC-DAD法同时测定三黄血清口服液 （黄芪， 黄芩， 黄柏， 党参， 白术等） 中 5 个成分 （原儿茶醛、 绿原酸、 黄芩苷、 丹酚酸 B、 汉黄芩素） 的量。 方法 采用 HPLC-DAD方法， ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） 色谱柱； 流动相为乙腈 （ A） -0.1%磷酸溶液 （ B） 梯度洗脱， 体积流量 1.0 mL/min， 柱温为 30 ℃， 检测波长为 278 nm （原儿茶醛、 黄芩苷、 汉黄芩素）、 286 nm （丹酚酸 B）， 320 nm （绿原酸）。 结果 5 个成分的峰面积与质量浓度的线性关系良好， 加样回收率为 97.7% ～101.6%。 结论 该方法简便、 准确、 灵敏， 重复性好， 可用于三黄血清口服液中多种指标性成分的质量控制。

三黄血清口服液；原儿茶醛；绿原酸；黄芩苷；丹酚酸B；汉黄芩素；多波长

三黄血清口服液是由复旦大学附属华山医院委 托上海上联药业有限公司生产的纯中药制剂，其成分主要由黄芪、黄芩、黄柏、党参、白术、茯苓、木通、 丹参、 牡丹皮、 红花、 苦参、 银花等 17味组成，具有清热润燥、活血散积的作用，主要用于治疗银屑病 （也就是俗称的牛皮癣）。本品为传统的口服液，《上海市食品药品监督管理局医疗机构制剂质量标准 SYZ-ZF-002-2009》 中只有对几味药材的薄层鉴别，缺少成分定量测定，无法有效评价各指标成分的内在质量。黄芩具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎等功效。银花具有清热解毒，凉血止痢，祛风散邪等功效。丹参具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈。为了更好地控制药品质量，保证公众用药的安全有效，本实验对这三味主要药材中的5种主要成分进行定量测定。目前对 5 个成分中其中 几 个成分的测 定 报 道 较 多［1-14］，3种药材中各个有效成分的量在同一系统测定未作任何报道。本研究以制剂中的黄芩、丹参和银花作为研究对象， 采用 HPLC-DAD梯度洗脱法在同一条件下、不同检测波长下分别测定三黄血清口服液中原儿茶醛、绿原酸、黄芩苷、丹酚酸 B、 汉黄芩素5个成分的量。经方法学考察结果令人满意，为该制剂的质量控制提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent HP 1100 高效液相色谱仪 （包括真空脱气机、四元泵、自动进样器、紫外检测器、 二极管阵列检测器）； 天平 AG 135 （0.01 mg，METTLER TOLEDO）； ZORBAX SB-C18色 谱 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 试药 乙腈为色谱纯， 水为超纯水，磷酸为分析纯。 对照品原儿茶醛 （1） （ 批号 110810-201007）、 绿原酸 （2） （批号 110753-200413）、 黄芩苷 （3） （批号 110715-200815）、丹酚酸 B （4）（批号 111562-201110）、汉黄芩素 （5） （批号1514-200001） 均来源于中国药品生物制品检定所。三黄血清口服液，复旦大学附属华山医院生产，批号为 20111028 （ 该批号为建立方法所用批号）、20110623、 20111022、 20111030。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 混合对照品溶液 分别精密称取原儿茶醛、绿原酸、 黄芩苷、 丹酚酸B、 汉黄芩素5个对照品适量， 加50%甲醇分别制成每 1 m L分别含原儿茶醛 38.88 μg、 绿原酸 409.2 μg、 黄芩苷 792.0 μg、丹酚酸 B59.66 μg、汉黄芩素 20.18 μg的溶液作为对照品贮备溶液， 再分别吸取 5.0 mL置 50 mL量瓶中， 加 50%甲醇稀释至刻度作为对照品混合溶液。

2.1.2 供试品溶液 精密量取 10 mL， 置 50 mL量瓶中， 用 50%甲醇振摇提取稀释至刻度， 摇匀，用微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按处方量制备缺黄芩、丹参、银花的阴性样品， 按 “2.1.2”项下方法制成阴性样品溶液，备用。

2.2 色谱条件及系统适用性考察 采用 ZORBAX SB-C18色谱柱 （4.6mm×250 mm， 5 μm）； 流动相梯度洗脱见表 1； 体积流量 1.0 m L/min； DAD检测器， 检测波长 278 nm （原儿茶醛、 黄芩苷、 汉黄芩素）， 286 nm （ 丹酚 酸 B）， 320 nm （ 绿 原酸）； 柱温 30 ℃；进样量 10 μL。 理论板数均不低于 10 000； 各成分之间的分离度均大于 1.5。 在上述色谱条件下，对照品、样品及阴性样品色谱图见图1。 由图1可见， 样品色谱图中色谱与对照品色谱相同保留时间处有色谱峰，而阴性样品无相应峰，说明样品中其他成分对以上5个成分的测定无干扰。

2.3 线性关系的考察 分别精密吸取上述对照品溶液 2、 5、 10、 20、30 μL，注入高效液相色谱仪， 按 “2.2” 项下色谱条件进行测定， 以各个对照品进样量 （ng） 为 X轴， 峰面积值为 Y轴计算回归方程、 相关系数和线性范围。 见表2。

表2 回归方程、相关系数及线性范围Tab.2 Regression equations、 correlation coefficient and linear range

2.4 精密度试验 精密吸取对照品混合溶液 10 μL， 按上述色谱条件连续进样 6 次， 记录各色谱图的峰面积。结果原儿茶醛、绿原酸、黄芩苷、丹酚酸 B、 汉黄芩素峰面积 RSD （n=6） 分别为0.8%、 0.3%、 0.2%、 1.6%、 0.7%。 表明仪器精密度良好。

图1 对照品混合溶液 （A）、 供试品溶液 （B）、 缺黄芩药材的阴性对照溶液 （C）、 缺丹参药材的阴性对照溶液 （D）、 缺银花药材的阴性对照溶液 （E） HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of references（ A），sam Ples （ B） ， negative sam Ple w ithout Scutellariae Radix （ C） ， negative sam Ple w ithout Salviae M iltiorrhizae Radix et Rhizoma （ D）， negative samPle Lonicerae Japonicae flos（E）

2.5 稳定性试验 取同一样品 （批号 20111028），按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别在 0、4、 8、 12、 24 h 进行测定， 测得峰面积并计算原儿茶醛、绿原酸、 黄芩苷、 丹酚酸 B、 汉黄芩素的RSD （ n=5 ） 分 别 为 1.0%、 0.8%、 0.8%、1.7%、0.9%。 表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.6 重复性试验 取批号为 20111028 的样品， 按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液， 按 “2.2” 项色谱条件测定，进行6次平行试验，结果原儿茶醛、绿原酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩素的平均质量 浓 度 分 别 为 22.33、 312.3、 655.2、 53.21、19.31 μg/mL。 RSD （ n=6 ） 分 别 为 1.9%、0.8%、 0.5%、1.7%、 2.0%。

2.7 加样回收率试验 分别精密量取已知含有量的样品 （批号 20111028） 5 mL置 50 mL量瓶中，精密加入 “2.1.1” 项 下 对 照品 贮 备 溶液 2.0、2.5、 3.0 m L， 每组 3 份， 共 9 份， 加 50%甲醇定容至刻度。 按 “2.1.2” 项下方法制备供试品溶液， 按 “2.2” 项色谱条件测定， 计算回收率。 结果见表3。

表 3 加样回收率试验结果 （n=3）Tab.3 Results of recovery tests（n=3）

2.8 样品测定 取3 批样品， 每批平行测定 3 次，按 “2.1.2” 项下的 方 法 制 备供试品溶 液，按“2.2” 项色谱条件进行分析， 记录峰面积， 按外标法计算。 结果见表4。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 取上述 5 个对照品， 在200 ～400 nm范围内进行扫描，结果原儿茶醛、 黄芩苷与汉黄芩素在 278 nm波长处有最大吸收，丹酚酸 B在 286 nm波长处有最大吸收，绿原酸在320 nm波长处有最大吸收。 所以本实验采用 DAD检测器，在3个波长处同时测定5个成分，结果很稳定。

表 4 样品测定结果 （μg·m L-1）Tab.4 Assay results of sam Ples（ μg·m L-1）

3.2 流动相的选择 本实验采用不同流动相比例的甲醇-0.6% 冰 醋 酸 溶 液［2］、 乙 腈-0.4% 磷 酸 溶液［7］、甲醇-乙腈-水-甲酸［8］、 乙 腈-0.05% 三氟乙酸［10］进行比较， 结果发现乙腈-0.1%磷酸溶 液梯度洗脱时，使各色谱峰保持良好的峰形，分离度均大于1.5， 理论板数均超过了 10 000， 并且阴性对照色谱中无干扰峰的出现。

3.3 溶剂的选择 本品是口服溶液， 采用不同比例的甲醇水溶液提取主成分， 发现 50%的甲醇振摇提取成分含有量最高，所以选择 50%甲醇作为提取溶剂，方法简便易行。

3.4 小结 本品是本市的医院制剂， 参照医疗机构医院制剂标准，缺少成分定量测定，未能有效地控制本制剂的质量。中药复方制剂总是由多味药组成，所以其药效是有很多种活性物质同时发挥而达到治疗效果。所以为了更好地控制本制剂的质量，本研究采用 HPLC-DAD法对三黄血清口服液中的 5个成分 （原儿茶醛、 绿原酸、黄芩苷、丹酚酸 B、汉黄芩素）采用梯度洗脱，进行同时测定，用DAD检测器验证5 个对照品与样品中 5 个成分的匹配度与光谱图均一致。本方法样品处理简便，方法准确，可为该制剂制定新的检测方法与质量标准提供参考价值。

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Sim ultaneous determ ination of five com Ponents in Sanhuang Serum Oral Liquid by HPLC-DAD

ZHANG Ping， YU Yong-mei， CHU Zhong-ying
（Shanghai Songjiang Institute for Food and Drug Control， Shanghai201600， China）

AIM To develop an HPLC-DADmethod for determining five components，including protocatechuic aldehyde， chlorogenic acid， baicalin， salvianolic acid B and wogonin in Sanhuang Serum Oral Liquid （ Astragali Radix， Scutellariae Radix， Phellodendri chinensis Cortex， Codonopsis Radix， Atractylodismacrocephalae Rhizoma， etc.）.M ETHODS Five components were analyzed on ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）with acetonitrile-water（containing 0.1%phosphonic acid） as mobile phases in gradient elution manner， 1.0 m L/min of flow-rate and 30 ℃ of temperature of column.The detection wavelength was set up at278 nm for protocatechuic aldehyde， baicalin， and wogonin， 286 nm for salvianolic acid B， and 320 nm for chlorogenic acid.RESULTS Five componentswere seperated perfectly and good liner relationshipswere obtained.The recoverieswere 97.7%-101.6%， respectively.CONCLUSION The developed method is simple， specific， accurate and with good reproducibility， which can be used for quality control of Sanhuang Serum Oral Liquid.

Sanhuang Serum Oral Liquid； protocatechuic aldehyde； chlorogenic acid； baicalin； salvianolic acid B；wogonin； multiwavelength

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）01-0094-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.023

2013-02-03

张 平 （1979—） ， 女， 主管药师， 从事药品质量研究及检验工作。 Tel： 13917001643， E-mail： flyingzp@sina.com