骨通贴膏指纹图谱及化学成分研究

夏 菁， 谢媛媛， 张宗璇， 张延惠， 王义明， 梁琼麟， 罗国安*

（1.江西中医学院， 江西 南昌 330004； 2.清华大学化学系， 北京 100084； 3.中国药科大学， 江苏 南京210009； 4.桂林天和药业股份有限公司， 广西 桂林 541001）

骨通贴膏指纹图谱及化学成分研究

夏 菁1，2， 谢媛媛2*， 张宗璇3， 张延惠4， 王义明1，2， 梁琼麟2， 罗国安1，2*

（1.江西中医学院， 江西 南昌 330004； 2.清华大学化学系， 北京 100084； 3.中国药科大学， 江苏 南京210009； 4.桂林天和药业股份有限公司， 广西 桂林 541001）

目的 应用 HPLC法建立骨通贴膏 （丁公藤、 麻黄、 当归、 干姜等） 指纹图谱并结合两种 LC/MS 联用技术进行多成分结构鉴定。 方法 以 AlltimaTMC18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） 为分析柱， 0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱， 检测波长为 280nm； 质谱定性采用飞行时间质谱 （TOF-MS） 结合离子阱多级质谱 （ Ion-trap/MSn）， 正、负两种离子模式扫描。 结果 以 Z-藁本内酯为参照物峰， 确定了骨通贴膏 HPLC指纹图谱， 指定了 19 个共有峰 （21个化学成分）， 10 批骨通贴膏 HPLC指纹图谱相似度大于 0.990。 结论 所建立骨通贴膏指纹图谱分析方法简单准确，稳定可靠，可用于其质量评价。

骨通贴膏；指纹图谱；高效液相色谱；飞行时间质谱；离子阱多级质谱

骨通贴膏由丁公藤、麻黄、当归、干姜、白芷、海风藤、乳香、三七、姜黄、辣椒、樟脑、肉桂油、金不换、薄荷脑等多味药材制备而成，辅料为橡胶、氧化锌、松香、羊毛脂、黄凡士林、月桂氮酮，具有祛风散寒、活血通络、消肿止痛的功效。现行的骨通贴膏质量标准收载于国家食品药品监督管理局国家药品标准 WS3-120 （Z-024） -2000（Z） -2010［1］，在 【鉴别】项下仅以东莨菪内酯、延胡索乙素、樟脑、薄荷脑及肉桂醛等对照品及当归对照药材等为指标进行薄层色谱或气相色谱鉴别，在 【含量测定】 项下利用薄层扫描法测定麻黄中盐酸麻黄碱的量，检测指标较少，且存在分析方法落后，操作复杂，检测灵敏度低等缺陷，难以全面表征骨通贴膏全面质量。

中药指纹图谱具有整体宏观和半定量分析等特点，是目前能够为国内外广泛接受的一种中药质量评价技术［2］， 它克服了仅仅依赖一种或几种指标成分的物理化学性质鉴别中药质量的局限性，从整体层面全面、 准确地体现中药质量［3］。 液相色谱-质谱联用技术 （LC-MS） 在中药复杂体系化学成分快速分离和鉴定方面已得到广泛应用。其中，液相色谱用于分离复杂成分，多种质谱联合检测用于化学成分鉴定。 飞行时间质谱 （TOF/MS） 与离子阱质谱 （Ion-trap/MSn） 联合应用是复杂样品成分鉴定的有效方法， TOF/MS 提供精确质量数， Iontrap/MSn可提供化合物的碎片信息用于结构解析，在中药缺少对照品的情况下，能较准确地获得复方中的化学成分信息［3-7］。

本实验采用 HPLC法建立了骨通贴膏的指纹图谱，经方法学验证，该方法具良好的重复性，符合指纹图谱测定要求，运用国家药典委员会研发的相似度计算软件， 对 10 批次的骨通贴膏指纹图谱进行了相似度评价， 结果相似度良好； 并通过 HPLCTOF/MS 及 HPLC-ion-trap/MSn联用技术对骨通贴膏中主要化学成分进行分析鉴定，为骨通贴膏的全面质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 SHIMADZU LC-2010A 色谱仪， 配有二元梯度 泵 LC-20AT， 二极 管 阵 列检测器 SPDM20A， LC solution 色谱工 作站 （ SHIMADZU， Japan） ； Agilent 1200 LC/MSD TOF高效液相色谱-飞行时间质谱连用仪， 配有二元梯度泵 G1312A， 二极管阵列检测器 G1315D， 电喷雾离子源 （ESI）（Agilent， USA）；Agilent 1100 series LC/MSD Trap高效液相色谱-离子阱质谱联用仪， 配有二元梯度泵 G1312A， 二极管阵列检测器 G1328A， 电喷雾离子源 （Agilent，USA）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 （郑州长城科工贸有限公司）； DLSB-10L/10低温冷却液循环泵及 HH-S 型水浴锅 （巩义市予华仪器有限责任公司）； RQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； Milli-Q Synthesis超纯水纯 化系 统 （ Millipore， USA）， 0.45 μm 滤 膜（天津津腾实验设备有限公司）。

1.2 试剂与样品 Z-藁本内酯对照品 （四川维克奇生物科技有限公司， 纯度≥98%）； 洋川芎内酯I、 洋川芎内酯 H对照品 （鼎瑞化工有限公司， 纯度≥98%）。 甲酸、 无水乙醇、 三氯甲烷 （分析纯， 北京化工厂）； 乙腈 （色谱纯， Merck KGaA）；Milli-Q超纯水 （自制）。 骨通贴膏共计 10 批 （批号分别为 20090449，20091006， 20090903，20090913，20090818， 20090933， 20090944， 20090707， 20090508，20090327）， 均由桂林天和药业股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 AlltimaTMC18色谱 柱 （4.6 mm× 250 mm， 5 μm）； 流动相 A为 0.1%甲酸水溶液，流动 相 B为 乙 腈， 梯 度 洗 脱； 体 积 流 量 1.0 mL/min；柱 温 25 ℃； 检 测 波 长 280 nm。进 样量 5 μL。

2.2 质谱条件

2.2.1 飞行时间质谱 电喷雾离子源 （ESI）； 采用正、负两种离子模式采集数据；质量扫描范围为50 ～2 200 m/z； 干燥气体积流量为 10 L/min； 干燥气温度为 350 ℃； 雾化气压为 35 psi（1psi= 6.895kPa）； 毛细管电压在正模式下为4 000 V， 负模式下为 3 500 V； 碎裂电压 175 V； Skimmer电压60 V； 八级杆 DC1 电压 -38.0 V；八级杆射频电压250 V； 采用分流比设置， 分流比为 1 ∶4； 试验数据采用 Analyst QS 软件处理。 测定样品之前， 使用校正液校准质量轴，以保证质量精度误差小于5 ppm； 元素组成计算参数设定如下： C≤60，H≤100， O≤30， N≤2， 环加双键数0 ～30； 容许质量范围100 ppm。

2.2.2 离子阱质谱 电喷雾离子源 （ESI）； 采用正、负两种离子模式采集数据；自动二级碎片分析； 质量扫描范围为 50 ～2 200 m/z； 干燥气体积流量为 10 L/min； 干燥气温度为 350 ℃； 雾化气压为 35 psi； 毛细管电压在正模式下为 4 000 V， 负模式下为3 500 V； 碎裂电压为 1.0 V； ICC目标参数为30 000， 累积时间为 200 ms； 采用分流比设置，分流比为 1 ∶4； 试验数据采用 Agilent化学工作站Rev.A.09.01 软件处理。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取 5.0 mg Z-藁本内酯对照品于10 mL量瓶中， 用无水乙醇溶解并定容配成质量浓度为 0.5 mg/mL的 Z-藁本内酯对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备 取本品 2 片， 除去盖衬，剪成小块， 置 250 mL具塞锥形瓶中， 加三氯甲烷50 mL， 超声溶脱 30 min， 加无水乙醇 100 mL， 摇匀，放置使溶液澄清，滤过，减压蒸干滤液，残渣用无水乙醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度， 摇匀， 经 0.45 μm微孔滤膜过滤， 作为供试品溶液。

2.5 测定方法 分别精密量取对照品溶液及供试品溶液5 μL进样， 以 Z-藁本内酯的色谱峰为参照峰，其余共有峰的保留时间和峰面积与之比值分别为相对保留时间和相对峰面积。

2.6 精密度试验 取同一批号 （批号 20090449）的供试品溶液， 按 “2.1” 项色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图，考察各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明，色谱图中各共有峰相对保留时间的 RSD为 0.04% ～0.57%，相对峰面积的 RSD为 1.83% ～4.80%，表明本仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批号 （批号 20090449）骨通贴膏， 重复制备 6 份供试品溶液，按 “2.1”项色谱条件进样测定6次，记录色谱图，考察各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明， 色谱图中各共有峰相对保留时间的 RSD为0.04% ～0.97%，相对峰面积的 RSD为 1.25% ～4.59%， 表明重复性良好。

2.8 稳定性试验 取同一批号 （批号 20090449）的供试品溶液， 按 “2.1” 项色谱条件分别在 0、2、 4、8、 12、24 h 进样测定，记录色谱图， 考察各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果表明，色谱图中各共有峰相对保留时间的RSD为 0.04% ～0.62%， 相对峰面积的 RSD为1.82% ～4.66%，表明供试品溶液在常温条件下可在24 h内保持稳定。

2.9 对照指纹图谱的生成及 10 批骨通贴膏指纹图谱相似度评价 利用上述指纹图谱测定方法，对10 批骨通贴膏进行指纹图谱检测，标定了 19 个共有峰， 见图 1、图 2。 利用国家药典委员会 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A版》 对 10 批骨通贴膏指纹图谱进行匹配， 以批号 20090449 色谱图为参照图谱， 设置时间窗为 0.1，采用中位数法生成骨通贴膏对照指纹图谱 （见图 1）。 计算 10批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，结果见表 1。 结果表明 10 批骨通贴膏指纹图谱相似度均大于 0.990， 相似度良好， 说明 10 批骨通贴膏质量稳定。

2.10 骨通贴膏化学成分分析 利用 HPLC-TOF/ MS 及 HPLC-ion-trap/MSn对骨通贴膏供试品溶液进行正、负离子扫描，两种模式下的总离子流图（见图3） 显示各化学组分在不同扫描模式下响应强度不一，因此对正离子和负离子两种模式进行采集，使获得的化合物信息互补。根据文献建立组方药材的化学成分信息库［8-13］， 利用 TOF/MS 获得的精确相对分子质量信息及 Ion-trap/MSn获得的多级碎片信息与库中成分进行比对，鉴定骨通贴膏化学成分，同时对色谱峰进行药材归属。通过以上方法， 本实验解析了骨通贴膏色谱图中 21个化学成分，分别归属于丁公藤、麻黄、当归、白芷、金不换、 海风藤、三七、 干姜、姜黄、 辣椒10味药材，结果见图3及表2。

图1 骨通贴膏对照指纹图谱Fig.1 Reference fingerp rint of Gutong Plsater

图 2 10 批骨通贴膏指纹图谱Fig.2 Fingerprints of 10 batches of Gutong Plsater

表 1 10 批骨通贴膏 HPLC指纹图谱相似度Tab.1 Sim ilarities of fingerprint for 10 batches of Gutong Plsater

图 3 骨通贴膏 TOF/MS总离子流图 （TIC） 及 HPLC色谱图Fig.3 TOF/M S total ion ch romatogram s（ TIC） and HPLC chromatogram of Gutong Plsater

3 讨论

3.1 在供试品制备方法的考察中，本研究分别对不同提取溶剂 （乙醇、 甲醇、 丙酮）， 不同提取方法 （超声、 热回流）和不同提取时间 （15 min、30 min、45 min、60 min） 进行了考察，并参照中药指纹图谱信息 “最大化” 原则，确定了供试品溶液的制备方法。

3.2 在色谱分析中， 流动相体系对色谱分离影响较大。 本实验分析测试了水-乙腈、 0.1%甲酸水-乙腈、 0.1%磷酸水-乙腈体系下骨通贴膏色谱图，通过比较发现流动相中加入一定比例的酸，可有效改善色谱峰分离效果及峰型， 0.1%甲酸水-乙腈、0.1%乙酸水-乙腈体系得到的指纹图谱整体峰形优于0.1%磷酸水-乙腈体系， 考虑到添加剂对质谱解析的影响， 最终选择了 0.1%甲酸水-乙腈流动相体系。柱温和体积流量是影响色谱行为的重要参数，骨通贴膏色谱图中色谱峰较多，柱温或体积流量的改变会影响色谱峰的保留值，进而影响分离效果。本实验比较了 25 ℃、 30 ℃、 35 ℃柱温下色谱图，选择分离效果最优的 25 ℃作为检测柱温， 当温度升高时， 部分区域的色谱峰 （例如 22、 23 号峰）分离度下降，甚至重叠，说明本方法对温度敏感，在试 验 时 应 控 制 柱 温 为 25 ℃。 对 0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min 体积流量下色谱图进行比较， 选 取 分 离 效 果 及 色 谱 峰 型 较 好 的 1.0 mL/min为最佳体积流量，当体积流量升高时， 27、28、 29 号峰产生重叠， 体积流量降低时， 22、 23号峰分离度下降，说明本方法对体积流量敏感，在试验时应控制体积流量为 1.0 mL/min。

3.3 骨通贴膏由丁公藤、麻黄、 当归等十余种药材提取制备而成，所含成分类型复杂，色谱响应行为千差万别。因此，用于其综合质量控制的指纹图谱检测波长的选择就显得尤为重要。 利用 HPLC/ DAD对骨通贴膏样品进行紫外全波长扫描， 色谱峰整体在 190 ～350 nm波长范围内吸收较强， 280 nm下色谱峰数最多， 且均有较好吸收， 可最大化地反应指纹图谱有效信息， 故选择 280 nm为骨通贴膏综合质量控制的指纹图谱检测波长。皂苷及麻黄碱类成分仅在低波长有吸收，因此选择 203 nm、280 nm两个波长进行全方化学成分研究。

表2 骨通贴膏化学成分的鉴定Tab.2 Identification of com pounds in Gutong Plsater

3.4 在质谱分析中， 19 号与 23 号峰均得到 m/z 271 的分子离子峰， 与成分信息库对比推测两者为欧前胡素或异欧前胡素。 23号峰二级质谱信息得到 m/z203 的碎片峰， 根据文献 ［14］， m/z 203［202+H］+是呋喃香豆素骨架与质子的耦合离子，为异欧前胡素特征碎片峰，且 19 号与 23 号峰的色谱行为符 合 文 献［14-15］中 欧 前 胡 素与 异 欧 前胡 素 的色谱行为， 因此判断 19 号峰为欧前胡素， 23 号峰为异欧前胡素。7号与8号峰的精确分子量与多级碎片信息相同，推测其为一对同分异构体，通过对照品比对， 确定 7 号峰为洋川芎内酯 I， 8 号峰为洋川芎内酯H。

3.5 本实验建立的骨通贴膏指纹图谱可较全面地反映骨通贴膏的内在质量，相似度分析可用于骨通贴膏的真伪鉴别及质量控制。 采用 HPLC-TOF/MS及 HPLC-ion-trap/MSn联用技术对骨通贴膏中的化学成分进行了快速鉴别， 检测鉴定了 21个分别源于丁公藤、麻黄、当归、白芷、金不换、海风藤、三七、 干姜、 姜黄、 辣椒 10味药材的特征成分，基本阐明了该复方制剂的化学组成，为多指标成分同时定量测定分析提供了理论依据，从而为骨通贴膏的全面质量控制奠定科学基础。

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HPLC fingerprint and chem ical constituents of Gutong Plaster

XIA Jing1， XIE Yuan-yuan2*， ZHANG Zong-xuan3， ZHANG Yan-hui4， WANG Yi-ming1，2，LIANG Qiong-lin2， LUO Guo-an1，2*
（1.JiangxiUniversity of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China； 2.Chemistry Department of Tsinghua University， Beijing 100084，China； 3.China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China； 4.Guilin Tianhe Pharmaceutical Co.， Ltd.Guilin 541001， China）

Gutong Plaster； fingerprint； HPLC； time-of-flightmass spectrometer； ion trap tandem mass spectrometer

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0571-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.027

2013-05-09

国家 “ 重大新药创制” 科技重大专项 （2011ZX09201-201-07， 2011ZX09201-201-23）

夏 菁 （1987—） ， 女， 硕士生， 研究方向： 中药质量控制。 Tel：（010） 62772265， E-mail： xiahuaz@126.com

*通信作者： 罗国安 （1946—） ， 男， 教授， 研究方向： 中药质量控制。 Tel：（010） 62781688， E-mail： luoga@mail.tsinghua.edu.cn谢媛媛 （ 1980—）， 女 （ 满 ） ， 博 士， 助 理 研 究 员， 研 究 方 向： 中 药 质 量 控 制。 Tel： （ 010 ） 62794103， E-mail：yuanyuan8078@gmail.com

ABSTRACT： AIM To establish a fingerprintmethod for analyzing Gutong Plaster（ Erycibes Caulis， Ephedrae Herba， Angelicae sinensis Radix， Zingiberis Rhizoma， etc） by HPLC and a combinative LC/MS method for the identification ofmulti-components in Gutong Plaster.METHODS An HPLC in combination with PDA detector was applied on AlltimaTMC18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） column in gradientelutionmanner using acetonitrile-0.1%formic acid solution as themobile phase.The flow rate was1 mL/min and the detection wavelength was set at280 nm.A combination of time-of-flightmass spectrometer（ TOF-MS） and ion trap tandem mass spectrometer（Trap-MSn）was used for qualitative analysis under positive and negative ion modes.RESULTS HPLC fingerprintof Gutong Plaster was established choosing Z-Ligustilide peak as the reference peak and nineteen common peaks（21 chemical constituents） were obtained from standard fingerprint chromatograms of ten batches with similarity no lower than 0.990.CONCLUSION The HPLC method with good precision and reproducibility can be used for the quality control of Guton Plaster.