新疆北疆部分地区PCV2的PCR检测及基因型分析

施研进 杨蓓 屈勇刚* 石家成 黄佐兴 杨媛 成池杰 王闯 张新银

（1石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2新疆泰昆集团，新疆昌吉 831100；

3新疆生产建设兵团农十师畜牧兽医站，新疆北屯 836000；4新疆石河子畜牧兽医站，新疆石河子 832000）

新疆北疆部分地区PCV2的PCR检测及基因型分析

施研进1杨蓓1屈勇刚1*石家成1黄佐兴2杨媛1成池杰3王闯3张新银4

（1石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2新疆泰昆集团，新疆昌吉 831100；

3新疆生产建设兵团农十师畜牧兽医站，新疆北屯 836000；4新疆石河子畜牧兽医站，新疆石河子 832000）

猪圆环病毒2型（PCV2）是猪源疾病中的主要致病原。为了解新疆北疆部分地区PCV2的感染情况及阳性毒株基因型。在石河子及北屯地区的屠宰场共采集了203份抗凝血液，采用PCR方法对血样进行PCV2检测，在分离的PCV2阳性毒株中，选取2株克隆、测序，并进行了同源性分析和遗传进化分析。结果在待检样品中，PCV2阳性感染率为7.9%（16/203）；两个阳性样品测得序列之间的同源性为100%，它们与PCV2a参照序列之间的同源性为86.4%～87.4%，与PCV2b参照序列之间的同源性为92.9%～96.4%；两个阳性样品的序列在构建的遗传进化树中与PCV2b参照序列同属于一个分支，亲缘关系较近。结果证实本研究中所获毒株属于PCV2b基因型，表明新疆北疆部分地区猪群中存在PCV2感染，其基因型为2b型。

PCV2；PCR检测；基因型分析

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2）引起的猪的一种多系统功能障碍性传染病。猪圆环病毒2型也是导致断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemwasting synd rome，PMWS）的病原体之一，与猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等多种引起母猪繁殖障碍的病毒混合感染，加重疾病病情，使治疗更为复杂。5～12周龄的仔猪为核心易感群体，其主要症状为呼吸困难、贫血、淋巴结病变和进行性消瘦等[1]。

猪单纯感染PCV2病毒时，并不一定显现临床症状，通常在受到猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等其他病原共同感染或受到疫苗免疫刺激时才会导致PCV2发展为PMWS。通常感染PCV2的猪群PMWS的发病率为5%～30%，死亡率高达20%～100%[2]。猪圆环病毒病的危害很大，给养殖业造成很大的经济损失。本文以在新疆北疆地区部分屠宰场采集的血液为样本，使用PCR检测方法，对PCV2的感染情况进行检测，为PCV2感染的后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 血液样品

在新疆石河子及北屯地区的部分生猪屠宰厂采集抗凝血液共203份，其中石河子地区采集131份，北屯地区采集72份。

1.2 主要试剂

血液基因组小量提取试剂盒、PCR扩增试剂2×EsTaq Master Mix、DNA Marker DM2000、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（均为北京康为世纪生物有限公司产品）；pMD18-T载体由TAKARA公司生产；感受态大肠杆菌（）DH5α由本实验室制备。

1.3 PCR引物设计

根据参考文献3合成了PCV2检测引物，用于扩增PCV2的非编码区序列，其序列见表1。

表1 PCV 2病毒引物序列

1.4 总DNA的提取

按照北京康为世纪生物有限公司血液基因组提取试剂盒说明书操作。其中提取DNA时，每份血液样品的用量为300μL，加入三倍体积的Bu ffer GR，其余步骤与操作说明相同。

1.5 PCR扩增

引物选用PCV2F和PCV2R（表1）。PCR反应体系为：2×EsTaq Master Mix 10μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL、Rnase-free water 7.6μL、DNA模板2μL，总反应体系为20μL。反应条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

1.6 PCR产物的鉴定

取PCR产物20μL，用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，通过凝胶成像仪观察电泳结果。

1.7 PCR产物的序列测定

PCR产物经过电泳、切胶后，通过DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化，连接至pMD18-T载体上，转入感受态细菌DH5α，通过氨苄抗性进行筛选。阳性克隆菌落经PCR进一步鉴定后，保存于50%的灭菌甘油中，送北京华大基因生物技术公司测序。

1.8 基因序列的同源性分析

猪群中流行的PCV2主要为PCV2a、PCV2b两种基因型。为此，本研究选取GenBank收录的国内外PCV2a、PCV2b两种基因型的全序列各3个，作为参照序列用于核酸序列的比较分析（表2）。

表2 PCV2序列分析所用的参照序列及来源

2 结果

2.1 PCR检测结果

对采集的猪抗凝血液进行PCR检测，得到的目的片段与PCV2阳性对照扩增的片段大小一致，约为487 bp（图1）。在检测的203份样品中，有16份样品PCR检测阳性。

图1 PCV2的PCR检测结果

2.2 同源性分析结果

选择两个阳性样品（PCV2-2和PCV2-3）进行测序，使用DNASTAR软件对序列进行分析，结果显示PCV2-2和PCV2-3之间的同源性为100%，它们与3个PCV2a参照序列之间的同源性为86.4%～87.4%，与3个PCV2b参照序列之间的同源性为92.9%～96.4%。

图2 PCV2毒株基因遗传进化分析结果

2.3 PCV2毒株基因遗传进化分析结果

将试验中所获PCV2核酸序列与GenBank参照序列共同构建遗传进化树，结果显示，本研究所获得的2个序列与PCV2b型参照序列亲缘关系较近，同处于一个分支（图2）。

3 讨论与结论

早在2000年，我国就有学者在吉林、河北、北京、河南、山东、天津、江西7个省（市）的20个猪场采集了共计559份血清，通过ELISA检测方法，检测了四种类型猪（未断奶仔猪、断奶仔猪、后备母猪及经产母猪）的PCV2抗体，发现阳性率为42.9%[4]。根据相关数据进行推测，我国猪场PCV2阳性率约在96%以上，各生产阶段有差异。疾病的发生率与致死率因猪场管理状况而有很大差异，发病率通常为4%～30%，致死率为70%～80%[5]，可见PCV2目前仍是造成养猪业巨大经济损失的病原体之一。本试验中，猪体本身未见明显的PCV2发病症状，检测的PCV2阳性感染率仅为7.9%（16/203），这与其他文献中提到的PCV2阳性感染率相比，差异较大。提示新疆石河子和北屯地区生猪PCV2阳性感染率较低，说明该地区猪群受PCV2侵害程度较轻。这可能是由于检测方法和取样的不同造成的，有待进一步分析。

根据基因组大小不同PCV2可分为2a和2b两种基因型。在欧洲和北美两种基因型均已被证实与猪圆环病毒病（PCVD）有关。Kathleen等[6]研究表明,2005年美国暴发的PCVD与2b型有联系。尽管大多数猪群感染和PCV2有关，但有学者认为PCV2的2个不同基因型在临床表现并不相同，即两者的毒力不同，普遍认为2b型的致病性要强于2a型[7]。从2003年开始，伴随着临床症状的加剧，全球猪群中PCV2流行的基因型逐渐由2a变成2b[8]。虽然现在市售的基于PCV2a的疫苗可以提供对PCV2b的交叉保护，但已研制出的基于PCV-2b的新型疫苗可以提供更高的保护力。本研究证实了新疆北疆石河子和北屯两地主要流行PCV2b型，为今后如何选用疫苗防制PCVD提供了理论依据。

[1] 许立华,芦银华,王玲,等.猪圆环病毒研究进展[J].中国病毒学,2004,19(3):288-290.

[2] 曹正.江苏省规模化猪场PCV-2流行病学调查与断奶仔猪多系统衰竭综合症的防治[D].南京:南京农业大学,2009.

[3] 王东方.猪圆环病毒PCR诊断方法建立及标准制定[D].郑州:河南农业大学,2008.

[4] 郎洪武,吴发权.断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J].中国兽医科技,2000,30(3):3-5.

[5] 徐苏标.猪圆环病毒病的流行及防控策略[J].今日养猪业, 2009(6):34-36.

[6] Lyoo KS,KimHB,Joo HS.Evalua tion of a nested polymerase chain reaction assay to d ifferentiate between twogenotype of porcine circovirus-2[J].Journal of Veterinary DiagnosticInvestigation,2008,20(3):283-288.

[7] 刘健,张维谊,鞠厚斌,等.猪圆环病毒2a/2b亚型病毒株毒力分析[J].中国畜牧兽医,2013,40(2):23-27.

[8] 徐磊,宁蓬勃,郭抗抗,等.猪圆环病毒2型疫苗研究进展[J].动物医学进展,2012,33(10):64-70.

S851.31+3

B

1673-4645(2014)03-0032-03

2013-09-06

新疆石河子市农业科技攻关项目（2013NY04）

施研进（1988-），女，河南汝南人，硕士研究生，主要从事动物传染病诊断与防治研究

*通讯作者：屈勇刚（1971-），男，陕西渭南人，副教授，硕士生导师，主要从事动物传染病快速诊断及防治技术研究，E-mail:quyonggang@shzu.ed u.cn